|
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
КОСИК ОКСАНА ІВАНІВНА
УДК: 581.1:633 /35:577.125:504.73
ТРАНСФОРМАЦІЯ ЛІПІД-ПІГМЕНТНИХ КОМПОНЕНТІВ ФОТОСИНТЕТИЧНИХ ТКАНИН Triticum aestivum L. ЗА УМОВ СВИНЦЕВОГО НАВАНТАЖЕННЯ
03.00.12 – фізіологія рослин
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ-2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі фізіології та екології рослин біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор,
членкор УААН
Мусієнко Микола Миколайович
Київський національний університет
імені Тараса Шевченка,
завідувач кафедри фізіології та екології рослин
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор,
академік УААН
Гудков Ігор Миколайович
Національний аграрний університет,
завідувач кафедри радіобіології
кандидат біологічних наук,
Гуральчук Жанна Захарівна
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України
старший науковий співробітник відділу
фізіології живлення рослин
Провідна установа: Інститут ботаніки імені М.Г. Холодного НАН України
Захист дисертації відбудеться “26”_січня_ 2004 року о _1600_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою:м. Київ, пр-т Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 434.
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 60, спецрада Д 26.001.24, біологічний факультет
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: м. Київ, вул. Володимирська, 58
Автореферат розісланий “_24_” грудня_ 2003 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Андрійчук Т.Р.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Вивчення стійкості та адаптації сільськогосподарських культур до дії несприятливих чинників зумовлене швидким зростанням в останні роки техногенного забруднення довкілля важкими металами, серед яких найбільшу небезпеку становлять іони свинцю (Глазовская, 1994; Трахтенберг, 1998; Weiss etc., 1999). Токсичність цієї групи речовин визначається темпами антропогенної емісії та здатністю до акумуляції у трофічних ланцюгах живих організмів (Кравців та ін., 2001; Самохвалова та ін., 2001; Лозановская и др., 1998). Зростання техногенних емісій швидкими темпами та збільшення концентрації свинцю у довкіллі доводить важливість вивчення і наукового дослідження механізмів його токсичного впливу на рослинний організм та з’ясування адаптивних змін фізіолого-біохімічних реакцій метаболізму для оцінки рівня стійкості рослин до даного полютанта з метою керування захисними та ремедіатаційними процесами, щоб уникнути екологічних криз агро- та фітоценозів.
Однією з перших неспецифічних реакцій в розвитку загального адаптаційного синдрому до надлишкових кількостей важких металів в середовищі є активація процесів пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ), яка призводить до перебудови метаболізму рослин як на рівні клітин, так і всього організму (Gallego etс., 1999; Cakmak, 2000; Clemens, 2001; Sandalio etс., 2001). Зростання вмісту продуктів ПОЛ може ініціювати деструктивні зміни різних компонентів клітини, найперше фотосинтетичного апарату, що негативно відбивається на функціональному стані рослин.
З’ясування фізіологічних основ толерантності рослин різної генетичної детермінованості до свинцевого навантаження дасть змогу оптимізувати вирощування сільськогосподарських культур за умов надлишку металу і може бути використане для фіторемедіації та фітомоніторингу.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалася в рамках держбюджетних науково-дослідних тем кафедри фізіології та екології рослин “Адаптивні реакції рослин в системі моніторингу агро-та фітоценозів за умов дії факторів довкілля та антропогенного забруднення ” (Р/№ РК 0101V003581) та “Гліколіпіди як субстрати сигнальних систем у механізмах формування адаптаційного синдрому рослин” (Р/№ ДР 0102V004060), де дисертантка була виконавцем окремих розділів згідно з планом науково-дослідних робіт.
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було з’ясувати особливості адаптивних реакцій пігмент-ліпідних компонентів рослин пшениці різної генетичної детермінованості залежно від варіабельності свинцевого навантаження, а саме:
концентрації іонів свинцю у середовищі,
шляхів надходження металу в рослини,
тривалості дії свинцевого стресора.
Для досягнення поставленої мети були визначені такі завдання:
провести скринінг інформаційних даних стосовно стану забруднення свинцем повітряного та грунтового простору міста Києва та Київської області;
дослідити вплив іонів свинцю на інтенсивність процесів ПОЛ в рослинних клітинах за активністю утворення первинних і вторинних продуктів пероксидації;
проаналізувати особливості зміни пігментного складу рослин різних сортів за умов свинцевого навантаження;
з’ясувати реакцію ліпідних компонентів мембран фотосинтетичних тканин пшениці за умов дії іонів свинцю;
встановити взаємозв’язки між якісним і кількісним вмістом пігментів, ліпідів та інтенсивністю процесів пероксидного окиснення у фотосинтетичних тканинах в різних за рівнем стійкості сортів озимої пшениці.
Об’єкт дослідження – процес адаптації рослин пшениці до токсичного впливу іонів свинцю.
Предмет дослідження - комплекс адаптивних реакцій рослин, що відбуваються за дії іонів важкого металу і виявляються у зміні ліпід-пігментних компонентів фотосинтетичних мембран.
Методи дослідження - застосування біохімічних методів виділення та ідентифікації ліпідів, пігментів, молекулярних продуктів пероксидного окиснення ліпідів фотосинтетичних мембран, методи тонкошарової хроматографії, спектрофотометрії та денситометрії, статистичного аналізу та математичної обробки даних.
Наукова новизна одержаних результатів. З’ясовано фізіолого-біохімічні аспекти толерантності рослин різної генетичної детермінованості до свинцевого навантаження, встановлено особливості адаптивних реакцій ліпід-пігментних компонентів пшениці залежно від варіабельності свинцевого навантаження: концентрації іонів свинцю у середовищі, тривалості впливу стресора, а також шляхів його надходження у рослини.
Вперше проаналізовано зв’язки між якісним і кількісним вмістом фотосинтетичних пігментів, ліпідів та інтенсивністю процесів ПОЛ за дії іонів свинцю. Обгрунтовано, що трансформації ліпід-пігментних компонентів фотосинтетичного апарату пов’язані з адаптивними процесами, прояв яких залежить від рівня генетичної детермінованості рослин, а також концентрації, способу надходження та тривалості впливу даного стресового чинника. Отримано нові результати про кількісні зміни гліколіпідів МГДГ, ДГДГ та СХДГ при вирощуванні пшениці на середовищі з підвищеним вмістом іонів свинцю, що може бути пов’язано із реорганізацією мембранних структур фотосинтетичного апарату, спрямованих на забезпечення необхідного рівня його функціонування. Проведено скринінг сортів пшениці різного екологічного походження на толерантність до дії іонів свинцю. Виявлено, що основною спрямованістю змін у рослин стійкого сорту є швидка стабілізація рівня ПОЛ, зростання вмісту МГДГ, СХДГ та підтримання стабільного рівня стеринів протягом вегетації.
Представлені у дисертації наукові розробки є теоретичною основою оптимізації вирощування сільськогосподарських культур за умов надлишку металу, які знайшли практичне застосування при фітомоніторингу агроценозів та у фіторемедіаційних заходах.
Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані можуть використовуватися у дослідницьких роботах з вивчення механізмів стійкості рослин до підвищених концентрацій важких металів у середовищі та розробці шляхів її регуляції для оптимізації вирощування основних сільськогосподарських культур в умовах антропогенного навантаження. Встановлені фізіолого-біохімічні зміни, що лежать в основі толерантності рослин до токсичної дії іонів свинцю, можуть бути використані при доборі стійких до надмірного свинцевого забруднення сортів озимої пшениці в умовах Київського Полісся, при визначенні потенційної спроможності рослин адаптуватися до впливу іонів важких металів та фітоіндикаційному прогнозуванні рівня забруднення агроценозів, а також використовуватися з метою фіторемедіації.
Основні положення дисертаційної роботи внесені до навчальних планів біологічних і сільськогосподарських спеціальностей вищих учбових закладів та використовуються при читанні загальних та спеціальних курсів – “Фізіологія рослин”, “Фотосинтез”, “Фізіологія стійкості рослин”, “Адаптаційний синдром у рослин”; у наукових програмах, пов’язаних з вирішенням проблеми стійкості рослин за умов дії несприятливих факторів довкілля Інституту фізіології рослин і генетики НАН України, Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, Інституту землеробства УААН, Інституту садівництва УААН, а також науково-дослідних станцій системи Міністерства аграрної політики України.
Результати досліджень та їх узагальнення доповнюють і поглиблюють існуючі уявлення про механізми розвитку стресу у рослин за умов токсичної дії іонів свинцю, а також можуть слугувати теоретичною основою для подальшого вивчення адаптивних можливостей рослин.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто здійснено інформаційний пошук та оцінка багаточисленних джерел літератури, розроблено робочі гіпотези, обгрунтовано методологію постановки експериментів, виконано модельні і польові дослідження. Інтерпретацію та узагальнення одержаних результатів проведено з науковим керівником проф. Мусієнком М.М., співробітниками кафедри д.б.н. Таран Н.Ю. і к.б.н. Оканенком О.А. та висвітлено у спільних друкованих працях.
Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати були апробовані на наукових семінарах кафедри, ІІ всеукраїнській конференції студентів та аспірантів “Біологічні дослідження молодих вчених на Україні” (Київ, Україна, 2002); конференції молодих вчених-ботаніків України “Актуальні проблеми флористики, систематики, екології та збереження фіторізноманіття” (Львів, Україна, 2002); 15-му Міжнародному симпозіумі досліджень рослинних ліпідів (Оказакі, Японія, 2002); 10-ій Міжнародній конференції з мікроелементів (Будапешт, Угорщина, 2002); 5-ому Міжнародному конгресі по вивченню транспорту та асиміляції сірки (Монтпельє, Франція, 2002); XXXII та ХХХІІІ симпозіумах європейського товариства з нових методів сільськогосподарських досліджень (ESNA) (Варшава, Польща, 2002; Вітербо, Італія, 2003).
Публікації. Результати дисертаційних досліджень представлені 14 друкованими працями, серед яких 5 статей у фахових вітчизняних та закордонних виданнях та 9 тез доповідей у збірках матеріалів міжнародних симпозіумів, конгресів і конференцій.
Структура і об’єм роботи. Дисертація складається із вступу, п’яти розділів основної частини, узагальнення результатів досліджень, висновків і списку використаних джерел літератури - 346 найменувань. Робота викладена на 170 сторінках машинописного тексту і містить 3 таблиці, 51 рисунок.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об’єктами досліджень були рослини озимої пшениці (Triticum aestivum L.) різних за екологічним походженням сортів Поліська 90 та Алий парус. Фізіолого-біохімічні дослідження проводили в лабораторних та польових умовах. У модельних експериментах рослини вирощували методом водної культури у контрольованих умовах освітлення (5000 лк), температури (20-25оС) і 16-годинному світловому періоді впродовж 7 діб. Потім проростки обробляли розчином нітрату свинцю в концентраціях 5х10-7 М; 5х10-5 М та 5х10-3 М шляхом кореневого та позакореневого внесення. Контролем слугували рослини, вирощені на дистильованій воді. Зразки для аналізів відбирали на 24, 48 та 72 годину від початку дії свинцевого навантаження.
Польові стаціонарні досліди здійснювали впродовж 3 вегетаційних періодів 2000-2003 років. Рослини озимої пшениці вирощували у дрібноділянкових дослідах. Площа ділянок 10 м2. Свинцеве забруднення створювали на посівах озимої пшениці сорту Поліська 90 та Алий парус шляхом позакореневого внесення 5х10-3 М розчину нітрату свинцю у фазу кущіння.
Досліджували вплив іонів свинцю різної концентрації на склад компонентів ліпід-пігментного комплексу у фотосинтетичних тканинах озимої пшениці та в ізольованих хлоропластах, які виділяли методом диференційного центрифугування (Гавриленко и др., 1975).
Інтенсивність процесів ПОЛ оцінювали за кількістю гідропероксидів ліпідів (Droilland etс., 1987) та продуктів, які взаємодіють з 2-тіобарбітуровою кислотою (ТБКАП) (Heath, Packer, 1968) у модифікації Андрєєвої (Андреева и др., 1988).
Екстракцію, розділення і кількісне визначення ліпідів проводили за методом Зілла та Хармона (Zill etс., 1962) у модифікації Яковенко та Міхно (Яковенко и др., 1971). Розділення ліпідів на фракції здійснювали методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) на силікагелі. Кількісно галактоліпіди та стерини визначали шляхом денситометрії на скануючому денситометрі фірми “Shimadzu” порівняно зі стандартами відповідних речовин (Yamomoto, 1980). Вміст сульфоліпіду вивчали за методикою Кіна (Kean, 1968).
Кількість пігментів вивчали спектрофотометрично загальноприйнятим методом (Arnon, 1949). Концентрацію білка у досліджуваних пробах визначали за методом Бредфорда (Brаdford, 1976) та Лоурі (Lowry etс., 1951).
Біологічна повторність дослідів 3-4 кратна. Математичну обробку даних здійснювали методом дисперсійного аналізу по Фішеру (Доспехов, 1985). Достовірність різниці між варіантами оцінювали за критерієм Стьюдента при рівні значущості Р<0,05.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Відомо, що надлишкові кількості важких металів у середовищі можуть призводити до загальних малоспецифічних фізіологічних та біохімічних змін (Howlett etс., 1997; Gallego etс., 1999; Piqueras etс., 1999; Cakmak, 2000; Sandalio etс., 2001). Однією з перших неспецифічних реакцій в розвитку загального адаптаційного синдрому є активація процесів ПОЛ, яка супроводжується змінами жирнокислотного складу ліпідів мембран, їх в’язкості та провідності, активності мембранозв’язаних ферментів (Чиркова и др., 1998; Курчій, 2000; Платонова и др., 2000; Liu etc., 2000; Лукаткин, 2002). Оскільки активація ПОЛ є неспецифічною реакцією, ми припустили, що адаптивні перебудови метаболізму рослин за умов досліджуваного нами свинцевого навантаження як на рівні клітин, так і всього організму, можуть бути спричинені характером зміни прооксидантно-антиоксидантної рівноваги. Зважаючи на те, що субстратом ПОЛ є ненасичені жирні кислоти (Мерзляк, 1999), одним з наслідків пероксидаційних процесів може бути трансформація складу гліколіпідів мембран фотосинтетичних тканин, що в свою чергу, призводить до змін у ліпід-пігментних співвідношеннях, впливаючи на перебіг фотосинтетичних процесів.
1. Інтенсивність процесів ПОЛ у фотосинтетичних тканинах пшениці за дії свинцевого навантаження.
Результати наших досліджень засвідчили зростання інтенсивності ПОЛ у фотосинтетичних тканинах пшениці за умов свинцевого навантаження, особливо із зростанням концентрації важкого металу в розчині та подовженням термінів впливу. Нами відзначено, що вміст первинних молекулярних продуктів ПОЛ на ранніх етапах онтогенезу пшениці зростав незалежно від способу надходження металу в рослини (рис.1).
Рівень гідропероксидних сполук перевищував контрольні значення у всіх досліджуваних варіантах. Проте інтенсивність окиснювальних процесів залежала від концентрації іонів свинцю у середовищі. Так, якщо на першу добу після обробки рослин кількість гідропероксидів ліпідів зросла на 65%, то на третю - більш, ніж у 2 рази, порівняно з контрольним варіантом. Таким чином, свинцева інтоксикація призводить до зростання рівня утворення гідропероксидів ліпідів, особливо за умов тривалого впливу. Оскільки встановлена біологічна дія важких металів як ініціаторів ПОЛ, то збільшення вмісту гідропероксидів у тканинах проростків пшениці при свинцевому навантаженні можна пов’язати з посиленням окиснювальних процесів ліпідів за даних умов. Гідропероксиди ліпідів, що утворилися, у подальшому можуть ініціювати нові ланцюги окиснення, сприяючи поширенню реакцій ПОЛ у мембранних структурах або поглиблювати ПОЛ до кінцевих етапів.
проростків озимої пшениці за умов різної концентрації іонів свинцю при позакореневому (а) та кореневому (б) внесенні металу в рослини: К – контроль; 1 – 5х10-7 M Pb2+; 2 - 5х10-5 M Pb2+; 3 - 5х10-3 M Pb2+.
Вивчення пероксидних процесів на одному з кінцевих етапів, показало накопичення вторинних продуктів ПОЛ – ТБК-активних продуктів. Нами відзначено тенденцію до зростання цього показника у тканинах пшениці за дії іонів свинцю, особливо із збільшенням терміну впливу та підвищенням концентрації металу в середовищі. Однак характер динаміки ПОЛ змінюється залежно від способу надходження токсиканта в рослину (рис. 2).
Рис.2. Динаміка вмісту ТБКАП (нМ/мг білка) у листках проростків озимої пшениці за умов різної концентрації іонів свинцю при позакореневому (а) та кореневому (б) надходженні металу в рослини: К – контроль; 1 – 5х10-7 M Pb2+; 2 - 5х10-5 M Pb2+; 3 - 5х10-3 M Pb2+.
При позакореневій обробці спостерігали поступове зростання вмісту ТБКАП впродовж експозиції, яке досягало максимуму на 72 годину у всіх дослідних варіантах. Цей факт, на нашу думку, можна пояснити особливістю фоліарного поглинання, при якому, очевидно, іони свинцю зв’язуються з компонентами кутикули. При поступовому вивільненні елемента відбувається нове надходження токсиканта у внутрішні структури листка, що відповідно стимулює наступну хвилю ПОЛ. А при кореневому внесенні максимальне зростання зафіксоване на 24 годину, після якої рівень ПОЛ нормалізується. Це свідчить про наявність ефективних детоксикаційних систем в корені, які нейтралізують іони свинцю і обмежують їх транспорт до надземної частини рослин.
Досліджуючи початкові етапи ПОЛ у фотосинтетичних тканинах сортів Поліська та Алий парус, ми відзначили зростання вмісту гідропероксидів ліпідів у дослідних рослин обох сортів впродовж усієї вегетації (рис.3, а). Проте вже на кінцевому етапі ПОЛ кількість вторинних продуктів пероксидації зростала тільки у рослин сорту Алий парус, а у сорту Поліська 90 - навпаки відзначено стабілізацію фракції ТБКАП (рис. 3, б).
Рис. 3. Вміст гідропероксидів ліпідів (а) та ТБКАП (б) у фотосинтетичних тканинах озимої пшениці сорту Поліська 90 та Алий парус впродовж вегетації 2002 року за умов свинцевого навантаження: ПК – Поліська 90, контроль; ПД – Поліська 90, дослід; АПК – Алий парус, контроль; АПД – Алий парус, дослід.
Це зниження можна пояснити з одного боку - можливим використанням малонового діальдегіда в кисневмісних органічних сполуках, а з іншого – його здатністю метаболізуватися через малонову кислоту в цикл трикарбонових кислот (Шаламов, Загайко, 1998). Таким чином, за умов впливу іонів свицю, нами виявлено тенденцію до меншої інтенсивності процесів ПОЛ у сорту Поліська 90 порівняно з Алим парусом. Відомо, що низький рівень пероксидації при дії стресора притаманний стійким рослинам (Чиркова и др., 1998; Калашников и др., 1999). Виходячи з наших досліджень, сорт Поліська 90 за даним показником є більш стійким до свинцевого навантаження, ніж сорт Алий парус.
2. Адаптивні зміни пігментного комплексу рослин пшениці на дію іонів свинцю.
Нами вивчено відповідну реакцію озимої пшениці на дію нітрату свинцю залежно від його концентрації, тривалості впливу, способу внесення та віку проростків. При зростанні концентрації свинцю від 5х10-7 М до 5х10-3 М підсилювалося інгібування фотосинтетичної активності рослин, причому за нетривалої дії (24 год) ступінь пригнічення вмісту фотосинтетичних пігментів був менший, ніж за тривалої (72 год). За нашими даними вміст суми хлорофілів у фотосинтетичних тканинах озимої пшениці за умов кореневого внесення низької дози (5х10-7 M Pb2+) не відрізнявся від контрольних значень впродовж експозиції. Підтримання стабільного рівня пігментів дослідними рослинами свідчить про добре розвинутий асиміляційний апарат, що забезпечує нормальне функціонування пігментної системи у стресових умовах, коли новоутворення пігментів сповільнено.
Суттєве зниження кількості хлорофілу, особливо за умов тривалого впливу свинцю (72 год) при позакореневій обробці, може бути наслідком його окиснення активними формами кисню, які утворюються внаслідок дії іонів свинцю, здатних ініціювати оксидний стрес. Таким чином, отримані результати свідчать, що при свинцевій інтоксикації спостерігається зниження вмісту хлорофілу, яке може бути наслідком його безпосереднього окиснення активованим киснем, зниженням його синтезу, а також взаємодії молекул хлорофілу з продуктами ПОЛ – гідропероксидами ліпідів та ТБКАП, що призводить до утворення ліпофусцинових продуктів окиснення (Мерзляк, 1989; Somashekaraiah etс., 1992).
На подальших етапах розвитку пшениці зміни пігментного складу вивчали у польових умовах на рослинах різних за стійкістю сортів. В процесі онтогенезу між дослідними і контрольними рослинами сорту Поліська 90 не виявлено суттєвої різниці у кількості хлорофілу, водночас у дослідних варіантах сорту Алий парус відзначено тенденцію до зменшення вмісту всіх пігментів.
Підсумовуючи результати досліджень можна зробити висновок, що рослини озимої пшениці особливо чутливі до іонів свинцю на ранніх етапах розвитку, де дія важкого металу негативно вплинула на вміст всіх компонентів пігментного комплексу, незалежно від способу внесення. У польових умовах зміни пігментів за дії свинцевого навантаження проявлялись у трансформації акцентів адаптивної реакції окремих складових комплексу залежно від рівня генетичної детермінації. Сортова специфіка даної залежності дозволила нам припустити, що вищий рівень адаптаційного потенціалу в умовах Київського Полісся притаманний рослинам сорту Поліська 90, оскільки перебудова метаболічних процесів за дії значних концентрацій іонів свинцю в середовищі була спрямована на стабілізацію фотосинтетичних процесів.
3. Трансформація ліпідного складу асиміляційного апарату рослин пшениці в умовах свинцевого навантаження.
Функціональні порушення та зміни в структурній організації фотосинтетичного апарату в умовах дії несприятливих чинників значною мірою пов’язані із станом ліпідів – компонентів тилакоїдних мембран (Оканенко и др., 1992; Климов и др., 1990; Новицкая и др., 1983; Силаева, 1978). Проведені нами дослідження динаміки вмісту гліколіпідів продемонстрували, що характер цих змін залежить від дозового навантаження, тривалості впливу та способу внесення металу в середовище (рис.4). За результатами нашого експерименту обприскування проростків пшениці низькою дозою (5х10-7 М) нітрату свинцю призводило до зростання вмісту моногалактозилдіацилгліцеролу (МГДГ) у дослідних рослин на 22-39% впродовж експозиції, відповідно кореневе внесення тієї ж дози токсиканту викликало зниження його вмісту на 19-30%. Однак, високі концентрації (5х10-5 М -5х10-3 М) важкого металу індукували пропорційне зростання рівня МГДГ, перевищуючи контроль на 72 годину вдвічі в обох варіантах внесення.
Рис. 4. Вміст МГДГ (мкМ / мг хлорофілу) у фотосинтетичних тканинах пшениці при позакоревому (а) та кореневому (б) поглинанні іонів свинцю різної концентрації: К – контроль; 1 – 5х10-7 М Pb2+ ; 2 – 5х10-5 М Pb2+ ; 3 – 5х10-3 М Pb2+
Аналогічна залежність спостерігалася і для дигалактозилдіацилгліцеролу (ДГДГ). Зокрема за умов дії низької концентрації іонів свинцю при позакореневому внесенні вміст ДГДГ поступово зростав, перевищуючи контроль на 45% через 72 години (рис. 5). У варіанті з додаванням відповідної концентрації іонів свинцю до субстрату рівень ДГДГ не відрізнявся від контролю. Цей ефект, на нашу думку, зумовлений існуванням бар’єрів в кореневій системі на шляху транспорту свинцю із субстрату до пагона, які дозволяють уникати високого рівня важкого металу в надземній частині рослин.За високої концентрації металу спостерігали значне зростання рівня ДГДГ, особливо із збільшенням часу експозиції. Так, динаміка змін при позакореневому внесенні 5х10-3 М Pb2+ через 24 години складала 54%, 48 годин – 88%, а на 72 годину зросла у 2 рази відповідно до контролю. При кореневому внесенні вміст ДГДГ зростав вдвічі вже на 24 годину експозиції. Ми вважаємо, що за умов позакореневого внесення переважає безпосередній вплив іонів свинцю, водночас як у випадку кореневого внесення відбувається системна відповідь організму на дію стресора, яка реалізується в експресії генів ДГДГ-синтетаз.
Слід зазначити, що більш залежним від дози іонів свинцю виявився вміст галактоліпідів при кореневому внесенні, а при позакореневому тільки високі концентрації нітрату свинцю стимулювали їхнє суттєве зростання.
Рис. 5. Вміст ДГДГ (мкМ/мг хлорофілу) у фотосинтетичних тканинах пшениці при позакоревому (а) та кореневому (б) внесенні іонів свинцю різної концентрації: К – контроль; 1 – 5х10-7 М Pb2+ ; 2 – 5х10-5 М Pb2+ ; 3 – 5х10-3 М Pb2+
Відомо, що МГДГ, на відміну від більшості ліпідів мембран утворює моношарові структури, які можуть пакувати хлорофіл-білковий комплекс у ліпідний матрикс (Murphy etс., 1999). Взаємодія МГДГ з ДГДГ та іншими ліпідами забезпечує формування рідинно-кристалічної ліпідної двошарової структури (Quinn etс., 1983; Uemura etс., 1999). Включення інвертованих міцел молекул МГДГ біля поверхні світлозбирального комплексу (СЗК) у мембранах тилакоїдів сприяє нормальному функціонуванню фотосистем (ФС) (Quartacci etс., 1995).
Проаналізувавши результати вивчення дії іонів свинцю в строго контрольованих умовах лабораторного експерименту, ми вважали за доцільне дослідити фізіолого-біохімічні зміни рослин пшениці різної генетичної детермінації в польових умовах. Отримані дані свідчать про залежність адаптивної відповіді рослини від стійкості сорту. Результати польових досліджень вказують на відносну стабільність фракції ДГДГ у рослин сорту Поліська 90 та збільшення її кількості у сорту Алий парус. Існує думка, що дія деяких стресорів призводить до зсуву рівноваги між бішаровими та моношаровими ліпідними структурами, внаслідок чого може змінюватися співвідношення ДГДГ/МГДГ (Kuipper etс., 1996). У сорту Алий парус нами виявлено підвищення цього співвідношення протягом онтогенезу, що може свідчити про перебудову у мембранних структурах тилакоїдів, спрямовану на зниження рівня небішарових компонентів МГДГ та збільшення їх стабільності й захищеності хлорофіл-білкових комплексів (рис. 6). У рослин сорту Поліська це відношення було незмінним, а стабілізація хлорофіл-білкових комплексів відбувалася, можливо, шляхом включення інших механізмів. Ми схильні вважати, що у стійкого сорту Поліська 90 захист фотосинтетичних структур забезпечується компенсацією пероксидного окиснення ліпідів, про що свідчать наші дані по визначенню ТБКАП в процесі вегетації цього сорту.
Рис. 6. Зміна співвідношення галактоліпідів у різних за стійкістю сортів озимої пшениці впродовж вегетації 2002 року при свинцевому навантаженні: ПК – Поліська 90, контроль; ПД – Поліська 90, дослід; АПК – Алий парус, контроль; АПД – Алий парус, дослід.
.
Зниження вмісту МГДГ та ДГДГ за умов свинцевого навантаження в польових умовах протягом онтогенезу у дослідних рослин сорту Алий парус може відбуватися за рахунок їхнього окиснення внаслідок подальшої інтенсифікації ПОЛ, що узгоджується з нашими експериментальними даними. Також можливий гідроліз молекул ліпідів з утворенням вільних жирних кислот, внаслідок окиснення яких утворються оксиліпіни – регулятори захисних реакцій рослин (Тарчевский, 1992). Таким чином, ми можемо припустити, що незначне зниження вмісту гліколіпідів за умов свинцевого стресу сприяє реалізації захисних механізмів рослин.
Дослідження впливу різноманітних несприятливих факторів довкілля на ліпідні компоненти мембранних структур рослин свідчать про особливості змін одного з представників класу гліколіпідів - сульфохіновозилдіацилгліцеролу (СХДГ) як компоненту мембран тилакоїдів, що відіграє специфічну роль у їхній структурній організації, впливаючи на формування двошарової структури з ДГДГ та регулюючи синтез МГДГ (Siegenthaler et al., 1987).
Вивчаючи динаміку вмісту СХДГ від початку дії свинцевого навантаження, нами встановлено зменшення кількості сульфоліпіду залежно від концентрації металу в середовищі (рис.7). У варіанті з позакореневим внесенням свинцю у концентрації 5х10-7 М спостерігалося зниження рівня сульфоліпідів порівняно з контролем більше, ніж у 2 рази через 24 години, на 37% через 48 годин, а на 72 годину він вже зростає на 26% (рис. 7, а). У варіанті з додаванням тієї ж дози свинцю в середовище вирощування відбувалося аналогічне падіння вмісту сульфоліпідів вдвічі на 24 годину, на 20% через 48 годин та на 40% через 72 години (рис. 7, б).
Рис. 7. Вміст СХДГ (мкМ/мг хлорофілу) у фотосинтетичних тканинах пшениці при позакореневій (а) та кореневій (б) обробці проростків пшениці іонами свинцю різної концентрації: К – контроль; 1 – 5х10-7 М Pb2+ ; 2 – 5х10-5 М Pb2+ ; 3 – 5х10-3 М Pb2+.
Різке зниження рівня сульфоліпідів в перші години експозиції, на нашу думку, може бути зумовлено двома причинами. По-перше, це можливість інтенсивного використання сірки для утворення специфічних пептидів – фітохелатинів, які забезпечують детоксикацію важких металів в клітині, шляхом хелатування. Це зрозуміло зважаючи на те, що в реакціях біосинтезу цистеїну та СХДГ постачальником сірки є аденозинфосфосульфат (АФС) (Schmidt etс., 1992). Також не виключено, що СХДГ може бути джерелом постачання сірки для синтезу цистеїну. По-друге, цілком ймовірною є можливість утворення комплексів сульфоліпіду зі свинцем. Схожу реакцію ми спостерігали in vitro. Зважаючи на те, що при вирощуванні у водній культурі постачання сірки обмежено запасами насінини, такі припущення є досить ймовірними.
На відміну від лабораторних дослідів, результати польових досліджень свідчать про залежність напрямків змін вмісту цієї речовини від генетично детермінованих особливостей сорту (рис. 8). Нашими дослідженнями було виявлено накопичення СХДГ у дослідних рослин стійкого сорту озимої пшениці Поліська 90 впродовж вегетації. Протилежний ефект відзначено для рослин сорту Алий парус, рівень сульфоліпідів у яких падав на 45% порівняно з контрольним варіантом. Протягом онтогенезу спостерігається вирівнювання показників у рослин обох сортів. Ми припускаємо, що зростання фракції сульфоліпіду у досліджуваного нами стійкого сорту (Поліська 90) з одного боку упереджує витрати сульфоліпіду на утворення фітохелатинів та безпосереднє зв’язування іонів свинцю, а з іншого - компенсує токсичний вплив останнього на роботу фотосинтетичного апарату.
Рис. 8. Вміст СХДГ у фотосинтетичних тканинах озимої пшениці сорту Поліська 90 та Алий парус протягом вегетації 2002 року: ПК – Поліська 90, контроль; ПД – Поліська 90, дослід; АПК – Алий парус, контроль; АПД – Алий парус, дослід.
На нашу думку, це може бути пояснено існуванням тісного зв’язку між кількістю хлорофілу та концентрацією СХДГ, оскільки саме він визначає орієнтацію молекул хлорофілу у мембрані (Anderson, 1975). Доведено існування тісного зв’язку між даним класом ліпідів та організацією і розташуванням СFo-СF1 АТФ-синтетазного комплексу мембран тилакоїдів (Pick etс., 1985). Крім того, сульфоліпід забезпечує ефективну взаємодію між компонентами СЗК ІІ (Krupa etс., 1987; Sigrist etс., 1988), бере участь в організації реакційних центрів обох фотосистем (Gounaris etс., 1985), а також зв’язує дигетеродимер D1/D2 реакційного центру ФС ІІ (Kruijff etс., 1998; Vijayan etс., 1998). Відзначене нами зростання вмісту СХДГ за умов дії стресового фактору може бути спрямоване на забезпечення оптимальних умов для функціонування хлоропластів.
УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕННЯ
Розглядаючи виявлені трансформації у вмісті та співвідношенні пігментів і ліпідів, рівні ПОЛ під впливом іонів свинцю, можна стверджувати, що їхньою основною спрямованістю у рослин стійкого сорту є швидка стабілізація рівня ПОЛ, зростання вмісту МГДГ, СХДГ та підтримання стабільного рівня ДГДГ і стеринів. Саме ці зміни за умов свинцевого навантаження сприяли реалізації адаптивного потенціалу сорту Поліська 90. Функціональним значенням констатованих трансформацій можна вважати наявність двох механізмів: знешкодження (зв’язування та детоксикація) іонів важких металів та зміни складу фотомембран з метою забезпечення оптимального перебігу фотосинтетичних процесів в умовах забруднення. Вперше проаналізовані нами зв’язки між якісним і кількісним вмістом фотосинтетичних пігментів, ліпідів та інтенсивністю процесів ПОЛ при свинцевій інтоксикації переконливо демонструють, що трансформації вмісту та відповідні зміни його співвідношеньу цих речовинах пов’язані з адаптивними процесами, інтенсивність перебігу яких залежить від генетично детермінованого рівня стійкості сорту, а також концентрації, способу надходження та тривалості впливу даного стресора.
ВИСНОВКИ
Домінуючим полютантом грунтово-повітряного простору міста Києва та Київської області виявлено свинець, з перевищенням ГДК в окремих точках від 1 до 89 разів згідно з моніторингом стану забруднення даної території.
Токсична дія свинцю на ранніх етапах онтогенезу озимої пшениці виявляється в інтенсифікації процесів ПОЛ у фотосинтетичних тканинах залежно від дози, тривалості дії стресора та способу його внесення. Утворення гідропероксидів ліпідів зростає із збільшенням концентрації іонів свинцю в середовищі та подовженням термінів його впливу. Максимальний рівень ТБК-активних продуктів за умов позакореневого внесення Pb2+ зафіксовано на 72 годину експозиції, а за кореневого – на 24 годину, що свідчить про ефективність детоксикаційних систем кореня.
Сортова детермінація рослин пшениці до дії свинцевого навантаження виявляється в активності перебігу ПОЛ: інтенсифікація останнього свідчить про чутливість сорту, тоді як стабілізація рівня ТБК-активних продуктів – про його стійкість до даного стресора.
Пігментний апарат рослин пшениці на початкових етапах розвитку характеризується підвищеною чутливістю до дії свинцю. Деградація пігментів після дії стресора впродовж онтогенезу спостерігається лише у рослин чутливого сорту.
Динаміка змін вмісту гліколіпідів фотосинтетичних тканин пшениці залежить від доз навантаження, тривалості впливу та способу обробки рослин іонами свинцю. За умов кореневого внесення виявлено залежність процесів накопичення МГДГ і ДГДГ від дози іонів свинцю. При позакореневому надходженні всі концентрації токсиканта стимулювали зростання вмісту галактоліпідів.
Рівень стеринів у дослідних рослин чутливого сорту озимої пшениці зростає у 2,8 рази за незмінної їх кількості у рослин стійкого сорту.
Генетично детерміновані зміни вмісту СХДГ у тканинах різних за стійкістю сортів можуть бути зумовлені утворенням фітохелатинів, прямих лігандів з іонами свинцю та стабілізацією ФС ІІ і фактору спряження фотофосфорилювання.
Трансформації ліпід-пігментних компонентів пшениці за умов свинцевого навантаження проявляються у швидкій стабілізації рівня ПОЛ, зростанні вмісту МГДГ, СХДГ та підтриманні стабільного рівня ДГДГ і стеринів у рослин стійкого сорту.
| 
