|
НАЦIОНАЛЬНА АКАДЕМIЯ НАУК УКРАЇНИ
IНСТИТУТ МIКРОБIОЛОГIЇ I ВIРУСОЛОГIЇ iм. Д.К.ЗАБОЛОТНОГО
МОСКАЛЕНКО
Наталiя Василiвна
УДК 579.841.11.22
СТРУКТУРНО-ФУНКЦIОНАЛЬНI ДОСЛIДЖЕННЯ
ЛIПОПОЛIСАХАРИДIВ Ralstonia solanacearum
03.00.07 - мiкробiологiя
АВТОРЕФЕРАТ
дисертацiї на здобуття наукового ступеня
кандидата бiологiчних наук
КИЇВ - 1999
Дисертацiєю є рукопис.
Робота виконана в Iнститутi мiкробiологiї i вiрусологiї iм. Д.К.Заболотного НАН України, м. Київ.
Науковий керiвник :
доктор бiологiчних наук,
ВАРБАНЕЦЬ Людмила Дмитрiвна
Iнститутi мiкробiологiї i вiрусологiї iм. Д.К.Заболотного,
завiдувач вiддiлом бiохiмiї мiкроорганiзмiв
Офiцiйнi опоненти :
член-кореспондент НАН України, доктор бiологiчних наук, професор МАЛАШЕНКО Юрiй Романович
Iнститут мiкробiологiї i вiрусологiї iм. Д.К.Заболотного,
завiдувач вiддiлом бiологiї газоокислюючих мiкроорганiзмiв
доктор медичних наук, професор
БОРИСОВ Вадим Анатольович
Київський унiверситет iм. Т.Г.Шевченка,
професор кафедри мiкробiологiї та загальної iмунологiї
Провiдна установа
Одеський державний унiверситет iм. I.I.Мечникова, кафедра мiкробiологiї.
Захист дисертацiї вiдбудеться “ 20_” жовтня__ 1999 р. о 10.00 годинi на засiданнi спеціалiзованої вченої ради Д 26.233.01 в Iнститутi мiкробiологiї i вiрусологiї iм. Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 252143, м.Київ, вул. Заболотного, 154.
З дисертацiєю можна ознайомитись в бiблiотецi Iнституту мiкробiологiї i вiрусологiї iм. Д.К.Заболотного НАН України за адресою: 252143, м.Київ, вул. Заболотного, 154.
Автореферат розiсланий _17 вересня_ 1999 р.
Вчений секретар
спецiалiзованої вченої ради
кандидит бiологiчних наук Л.М.Пурiш
Актуальність проблеми. Ліпополісахариди (ЛПС) являються специфiчними компонентами клітинної оболонки грамнегативних бактерій. Вони розташованi на зовнішній поверхнi мембрани мікроорганізму і внаслідок своєї унікальної будови виконують ряд важливих для клітини фізико-хімічних і біологічних функцій. ЛПС відіграють значну роль у підтримці цілiсності мембрани, регулюють її проникність для різних сполук, приймають важливу участь у контактах мікроорганізму з іншими макро- та мiкроорганiзмами. Завдяки поверхневому розташуванню і особливостям будови визначають О-антигенну специфічність бактерій.
Одним iз пояснень прояву такого широкого спектру бiологiчної активностi є рiзноманiтнiсть молекулярних форм ЛПС в межах одного виду, що обумовлено гетерогеннiстю їх структурних частин, а саме О-специфiчного полiсахариду (О-ПС), корового олiгосахариду (кор-ОГ) та лiпiдного компоненту. Вивчення структурної органiзацiї рiзних молекулярних форм ЛПС однiєї культури та з’ясування їх хiмiчної природи сприяють розшифруванню детермiнант бiологiчної активностi i механiзмiв функцiонування ЛПС при реалiзацiї бiологiчних процесiв, що проходять за їх участю.
Склад і структура ЛПС є на сьогодні одним із визнаних хемотаксономічних критеріїв, що використовується в систематиці грамнегативних бактерій. Хiмiчна рiзноманiтнiсть типiв структур О-специфiчного полiсахариду ЛПС обумовлює серологiчну специфiчнiсть, що широко використовується при створенні вакцин і діагностикумів, а також при розробці внутрішньовидових серологiчних класифікаційних схем грамнегативних мікроорганізмів, в тому числі фітопатогенних.
Все вищезгадане цiлком стосується такого гетерогенного за властивостями i ще недостатньо вивченного фiтопатогенного виду, як Ralstonia solanacearum.Цей мікроорганізм викликає бактеріальне зів’ялення широкого спектру рослин ( до 200 видів). Особливо небезпечний він для представників родини пасльонових. Хвороба, яку вiн спричиняє наносить значнi збитки сiльському господарству. Найчастiше вона має незворотнiй характер i бiльшiсть iнфiкованих рослини гине.
Особливістю виду R. solanacearum є штамове різноманіття біологічних властивостей. Це робить можливим розподілення штамiв на раси, біовари, патовари, серовари за типом колоній, спеціалізації до фагів і т. і. Вивчення фізико-хімічних властивостей цього фітопатогену, зокрема особливостей будови i бiологiчної активностi ЛПС штамiв R. solanacearum є актуальною проблемою. Одержані внаслідок таких досліджень відомості можуть бути використані для розробки методів діагностики штамів цього виду, вирiшення питань його таксономiї, а також при дослiдженнях, спрямованих на вивчення механiзмiв патогенезу хвороби, яку викликає цей мiкроорганiзм.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами Робота виконувалась у відділі біохімії мікроорганізмів Iнституту мікробіології i вірусології iм. Д.К.Заболотного i включає дослiдження виконанi згiдно плану науково-дослiдних робiт iнституту за темами:
- “Изучить структурные и внеклеточные гликополимеры и ферменты микробной клетки с целью создания новых подходов хемосистематики и разработки новых биотехнологий” ( 1988-1992 гг., № гос. рег. 0.188.0.052916);
- “Вивчення молекулярних механiзмiв функцiонування глiкополiмерiв i карбогiдраз, розробка бiотехнологiй препаратiв для практичного застосування” (1993-1997 рр, 07/11),
а також конкурсних проектів науково-технічних програм:
- “Розробити нові ефективні препарати полісахаридів для профілактики та лікування онкологічних, токсико-інфекційних захворювань, імунодефіцитних станів” (1992-1994 рр., програма “Здоров’я людини”, № проекту 1.02.02/015-92) ;
- “Вивчити імуномодулюючі властивості глікополімерів бактерій, встановити структуру і конформацію детермінант біологічної активності та конструювання на їх основі препаратів для лікування імунодефіцитних станів” (1992-1995 рр., Державна науково-технічна програма “Біотехнологія”, № проекту 1.11.05/003-92).
Мета роботи. Метою дослiдження було вивчення складу i структури, а також деяких аспектiв бiологiчної активностi (iмунохiмiчнi властивості та iмуномодулююча дiя) ЛПС та їх окремих структурних компонентiв штамiв R. solanacearum - представникiв рiзних бiоварiв, якi вiдрiзнялись мiж собою також за географiчним походженням i рослиною-хазяїном .
Завдання дослідження
- Одержати ЛПС та їх окремi структурні компоненти iз 17 штамiв R. solanacearum .
- Вивчити хiмiчний склад (моносахаридний, амінокислотний та жирнокислотний) структурних частин молекули ЛПС різних штамів.
- Встановити хімічну структуру О-специфічних полісахаридів досліджуваних ЛПС .
- Вивчити імунохімічнi властивостi ЛПС R.. solanacearum з метою встановлення можливої кореляцiї мiж серологiчною активнiстю ЛПС та структурою його О-ПС.
- Дослiдити iмуномодулюючу (iнтерфероногенну, протипухлинну) дiю ЛПС та встановити внесок окремих структурних компонентiв молекули на прояв цiєї дiї.
Наукова новизна одержаних результатів.
Вперше проведено широке систематичне вивчення ЛПС і їх окремих структурних компонентiв штамів R. solanacearum, що відрізнялися приналежністю до певного біовару і які було вилучено із різних рослин та рiзних географiчних зон свiту.
Встановлено, що О-ПС R. solanacearum представлені три-, тетра- та пентасахаридними лінійними або розгалуженими ланцюгами, що повторюються. Варіації в їх будові дали змогу розподілити О-ПС досліджуваних штамів на 7 структурних типів , 6 з яких описані вперше.
З’ясовано, що більшість досліджуваних штамів R. solanacearum гете-рогенна за складом ЛПС, які містять більше ніж один тип структури О-ПС.
Для виду R. solanacearum вперше проведені порівняльні дослідження залежності серологічної активності ліпополісахаридів від структурних особливостей їх О-ПС і визначено, які з них є суттєвими в прояві цієї активності.
Вперше показана здатність ліпополісахариду R. solanacearum і його окремих структурних компонентів проявляти інтерфероногенну та антиметастатичну дію.
Практичне значення одержаних результатів
Одержані дані про хiмiчний склад і особливостi будови ЛПС та їх окремі структурні компоненти можуть бути використані для вирiшення нез’ясованих питань біології та систематики виду R. solanacearum , а саме, при досліжденнях, присвячених уточненню внутрішньовидового таксономічного стану представникiв цього гетерогенного виду, а також при дослідженнях фізiології та механізмів патогенезу хвороби рослин, яку він викликає. Проведені серологічні дослідження являються передумовою для подальших робіт, направлених на створення на основі О-антигенності ліпополісахаридів серологічної класифікаційної схеми виду R. solanacearum, що дасть змогу для ідентифікації штамів цього фітопатогену.
Вiдомостi, одержанi при вивченнi впливу ЛПС R. solanacearum та їх окремих структурних компонентiв на iмунну систему макроорганiзму необхідні при розробцi препаратiв направленої дiї на рiзнi ланцюги iмунiтету.
Апробація результатів дисертації . Основнi результати i положення дисертацiї доповідались та обговорювались на Всесоюзній школі-конференції молодих вчених (Алушта, 1990); конференції фундаментальних досліджень Iнституту мiкробiологiї і вiрусологiї iм. Заболотного (Київ, 1993); I Установ-чому з’їзді Українського мікробіологічного товариства (Одеса, 1993); XVII Мiжнародному симпозiумi по вуглеводам (Оттава, 1994); 5-тiй Мiжнароднiй конференцiї з проблем патовару Pseudomonas syringae та спорiднених патогенiв (Берлiн, 1995); Європейському симпозiумi з вуглеводiв “Eurocarb-9” ( Голандiя, 1997).
Публiкацiї. За матерiалами дисертацiї опублiковано 9 статей, з яких 2 - в мiжнародних журналах, 3 - в журналах Росiйської академiї наук, 4 - в журналах Нацiональної академiї наук України.
Особистий внесок здобувача. Основнi експериментальнi данi були одержанi здобувачем особисто: одержано бактерiальнi маси 17 досліджуваних штамів Ralstonia solanacearum, з яких видiлено ЛПС та їх окремi структурнi компоненти: О-ПС, кор-ОГ та лiпiди А. Проведено визначення моносахаридного, амiнокислотного та жирнокислотного складу одержаних ЛПС та їх окремих компонентiв. Метилювання, перйодатне окислення, дезацетилювання, дезамiнування, розпад за Смітом, встановлення конфігурації моносахаридів проведено особисто. Встановлення структур О-ПС дослiджуваних штамiв проведено спiльно з д.х.н. Кнірель Ю.О., д.х.н. Шашковим О.О. та к.х.н. Кочаровою Н.О. (Інститут органічної хімії ім. Зелинського, Москва). Iммунохімічні дослідження проведено особисто, автор висловлює подяку к.б.н.Кавун Е.М. (Iнститут бiохiмiї iм. Палладiна, Київ) за допомогу в розробцi умов проведення iмуноферментного аналiзу для дослiджуваних препаратiв. Встановлення iнтерфероногенної активностi ЛПС здiйснено спiльно з д.м.н. С.Л.Рибалко та к.м.н. Дядюн С.Т. (Iнститут епiдемiологiї та iнфекцiйних хвороб iм. Громашевського, Київ); визначення протипухлинної дiї ЛПС проведено за участю к.б.н. О. Е. Придатко та інж. Жукової О.В. (Iнститут експериментальної патологiї, онкологiї та радiологiї НАН України, Київ). Автор висловлює щиру подяку к.б.н. Мурас В.О. та iнж. Житкевiч Н. В. (Iнститут мiкробiологiї та вiрусологiї iм. Заболотного) за допомогу у пiдтримцi мікробіологічно “чистої“ культури дослiджуваних штамiв.
Структура та об’єм роботи. Дисертацiя складається з вступу, огляду лiтератури, опису матерiалiв та методiв дослiдження, експериментальної частини, яка включає виклад у чотирьох роздiлах результатiв роботи та їх обговорення, висновкiв, а також списку лiтератури, який охоплює 139 публiкацiй. Робота викладена на 145 сторiнках машинописного тексту. Фактичний матерiал дисертацiї подано у виглядi 31 рисункiв та 29 таблиць.
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
У двох підрозділах викладено відомості про біохімічні властивості та фітопатогенну дію представників виду R. solanacearum; про сучасний стан таксономічного положення цього виду, в систематиці якого на протязі останніх років відбулось декілька змін; про склад і будову ЛПС фітопатогенних бактерій родин Ralstonia, Burkholderia, Pseudomonas.
РОЗДІЛ 2.МАТЕРIАЛИ ТА МЕТОДИ
Об’єктами достiдження були 17 штамiв Ralstonia solanacearum. Всі культури були люб'язно надані куратором ICMP доктором Дж. Янгом (Нова Зеландія), за що ми висловлюємо йому щиру подяку. Штами були виділенi в рiзних географiчних зонах свiту із різних рослин і за своїми властивостями віднесенi до різних біоварів (табл. 1).
Культивування бактерiй проводили на рiдкому синтетичному середовищi, що мiстило як джерело вуглецю глюкозу, а азоту - хлористий амонiй (Vidaver).
Видiлення та очищення ЛПС проводили за методом Вестфаля та Янна. Деградацiю ЛПС проводили м’яким кислотним гiдролiзом в 1% оцтовiй кислотi. Ультрацентрифугуванням (40 хв., 25000 g) вiддiляли гiдрофiльнi та гiдрофобнi частини деградованого ЛПС. Окремi вуглеводнi компоненти молекули ЛПС одержували гель-хроматографiєю на сефадексi G-50 з використанням 0.025М пiридин-ацетатного буферу, рН 4,5. Визначення кiлькостi вуглеводiв здiйснювали за Dubois, нуклеїнових кислот - за Спiрiним,
Таблиця 1
бiлку - за Lowry. Гептози визначали реакцiєю з цистеїном та сiрчаною кислотою, КДО - реакцiєю з тiобарбитуровою кислотою. Iдентифiкацiю нейтральних моносахаридiв здiйснювали методом газово-рiдинної хроматографiї препаратiв у виглядi ацетатiв полiолiв на газовому хроматографi “Chrom-5”. Iдентифiкацiю та визначення вмiсту амiнокислот та гексозамінів проводили на аналiзаторi амiнокислот “Hitachi”. Визначення жирнокислотного складу лiпiдiв А проводили на газовому хроматографi “Цвет-100”, аналiзуючи препарати у виглядi метилових ефiрів жирних кислот, наявнiсть оксикислот пiдтверджували трифторацетилюванням.
Структури О-ПС встановлювали з застосовуванням бездеструктивних (1Н- та 13С-ЯМР-спектроскопія) та деструктивних (перйодатне окислення, розпад за Смітом, метилювання, дезацетилювання, дезамінування) методiв, а також за допомогою метода комп'ютерного аналізу (Lipkind et al.).
Iмунохiмiчнi властивостi ЛПС вивчали застосовуючи метод твердофазного iмуноферментного аналiзу.
Iнтерферонiндукуючу активнiсть встановлювали в дослiдах in vitro. Iндукцiю iнтерферона проводили шляхом внесення в суспензiю лейкоцитiв периферiйної кровi людини ( 5х106 клiтин на 1 мл) полiсахарида в кiнцевiй концентрацiї 200 мкг в пробi. Активнiсть iнтерферону визначали за здатнiстю пригнiчувати цитотоксичну дiю 100 тканинних цитоплазматичних доз (ТЦД) в 1 мл вiруса-iндикатора (вiрус везикулярного стоматиту). За одиницю активностi iнтерферону (IО50/мл) приймали значення, обернене його максимальному розведенню, що запобiгало на 50% цитопатичнiй дїї 100 ТЦД ВВС в культурi лейкоцитiв людини лiнiї L41, що перевивалися.
Дослiдження протипухлинної активностi проводили на п’яти пухлинних штамах: метастазуюча карцинома легенiв Льюїс (3LL) та меланома В-16; асцитна саркома S-37 (недиферинцiйована полiморфноклiтинна саркома) i два лейкозних штами - лiмфоїдна лейкемiя L1210 i лiмфоцитарна лейкемiя Р-388. Протипухлинний ефект оцiнювали по iнтенсивностi росту значних пухлин (визначення їх розмiру) i кiлькостi клiтин в асцитичнiй рiдинi при асцитнiй формi росту ( саркома S-37). Антилейкозну активнiсть визначали на пiдставi пiдрахунку загальної кiлькiстi клiтин в асцитичнiй рiдинi i за тривалiстю життя тварин. Як показник антиметастатичної активностi дослiджували середнiй сумарний об’єм метастазiв i їх кiлькiсть на одну тварину.
Результати дослідів статистично обробляли, використовуючи коефiциент Ст’юдента.
РОЗДІЛ 3. ВИДIЛЕННЯ ЛIПОПОЛIСАХАРИДIВ R. solanacearum , ВИЗНАЧЕННЯ ЇХ КОМПОНЕНТНОГО СКЛАДУ
Із 17 досліджуваних штамів R. solanacearum одержані бактеріальні маси, з яких у подальшому виділенi ЛПС. З'ясовано, що для представників виду R. solanacearum, більша частина ЛПС (від їх сумарного вмісту) екстра-гується у водний шар водно-фенольної сумiшi : 70-85% (у фенольній фрак-ції виявляли 30-15%). Таке розподілення між фракціями реакцiйної сумiшi вказує, що до складу досліджуваних ЛПС входять переважно гідрофільні ком-поненти. ЛПС із фенольної фракції набагато більше забруднені нуклеїно-вими кислотами, ніж ЛПС із водного шару (відповідно, 40-50 та 20-35%). За якiсним складом ЛПС із фенольної та водної фракцій не вiдрiзнялись.
Встановлено, що штами даного виду відрізняються між собою відносним вмістом ЛПС: хоча екстракція ЛПС всіх досліджуваних штамів відбувалась за однакових умов, їх кінцевий вихід по відношенню до сухої бактеріальної маси між окремими штамами коливався від 1,2 % у R. solanacearum шт. 7942 до 15,4 % у шт. 7956, для більшості ж штамів він становив 5-10%. Треба вiдзначити, що за вiдносним вмiстом ЛПС представ-ники виду R. solanacearum декiлька вiдрiзняються вiд iнших грамнегативних бактерiй, для яких вмiст цих сполук складає в середньому вiд 1 до 5 %.
ЛПС всiх дослiджуваних штамiв були вільні від домішок білку, вміст якого визначався слідовими кількостями. Але всi ЛПС характери-зувалися достатньо високим вмістом нуклеїнових кислот (до 35 %), позбав-лялися вiд яких застосовуючи декілька циклів ультрацентрифугування, при цьому їх вміст зменшувався до 1,5-5 %. Однак для ЛПС деяких штамів, заз-начений метод виявився недостатньо ефективним - після ультрацентрифугу-вання вміст нуклеїнових кислот залишався досить високим (вiд 6 до 13,5 %). Для ЛПС цих штамів проводили подальше очищення за допомогою насиченого розчину трихлороцтової кислоти. Виявлено, що цей метод очищення набагато дійовіший (вміст нуклеїнових кислот зменшувався до 0, 5 - 2 %), однак при його застосуванні збитки кількості ЛПС значно більші.
Аналіз моносахаридного складу ЛПС показав, що домінуючим моносахаридом всіх ЛПС є рамноза (70 - 90 %). ЛПС практично всіх штамів мали глюкозу (1 -23 %), за цим показником декілька виділявся серед інших шт. 7956 (35 %). Характерною виявилась також ксилоза (1-8 %) . ЛПС деяких штамів мали менш поширені для даного виду вуглеводні залишки: рибозу, галактозу, манозу та арабiнозу. Вмiст гептоз, в залежності від штаму, складав від 0,5 до 3,0 %. До складу всіх ЛПС входив в достатньо значній кiлькостi глюкозамін (4-18 %), в ЛПС двох штамiв (шт. 7944 та 8089) визначено ще і галактозамін.
Щодо амінокислотного складу ЛПС, то ці сполуки являються мінорними компонентами. За якісним складом картина їх розподілення досить різноманітна: представлені майже всі амінокислоти (за виключенням лейцину та тирозину), але найбільш поширеними виявились аланін та гистидин, з перевагою аланіну у кількісному відношенні.
Деградацiєю i подальшою гель-хроматографією вуглеводної частини деградованого ЛПС отримані окремi структурнi компоненти молекули. ЛПС всіх досліджуваних штамів за своєю структурою належать до S-форми – складаються із О-специфічного полісахариду, олігосахариду кору та ліпіду А. Для більшості штамів було характерно розділення вуглеводної частини на три піки (О-ПС та кор-ОГ) - рис. 1. Особливістю другої групи, що представлена 4 штамами (шт. 766, 8072, 8110 та 8202), була наявність ще однієї, більш високомолекулярної фракції ( у кількісному відношенні значно меншої - лише 3-8 % від фракції О-ПС) - рис. 2. За якісним складом О-ПС і О’-ПС практично не відрізнялись, різниця була обумовлена, як правило, більшим вмістом глюкози у складі О’-ПС.
рис. 1 Профіль елюції деградованого ЛПС R.solanacearum шт. 5712
рис. 2 Профіль елюції деградованого ЛПС R.solanacearum шт. 8110
РОЗДІЛ 4. СТРУКТУРНI КОМПОНЕНТИ ЛІПОПОЛІСАХАРИДІВ
О-специфiчнi полiсахариди
Домінуючим моносахаридом О-ПС досліджуваних штамів була рамноза (60 - 93%). Для багатьох штамів характерними були також ксилоза (3 - 12 %) та глюкоза (2-19%). О-ПС деяких штамів містили невелику кількість арабінози (1-6 %), а також галактози (1-10%) і лише О-ПС шт. 8089 відрізнявся від інших значним вмістом останньої - 31,6 %.
Для всiх О-ПС визначено значну кількість глюкозаміну (5-20%). До складу О-ПС трьох штамів (шт. 7944, 7955 та 8089) входив також галактозамін. У своїй більшості досліджувані О-ПС були вільні від амінокислот і лише О-ПС окремих штамiв містили одну чи двi амінокислоти в дуже низьких концентраціях (0,1-0,7%), причому, перевага, як і в разі ЛПС, була за аланіном та гистидином.
Виходячи з аналiзу 1Н- та 13С-ЯМР-спектроскопії встановлено, що О-ПС дослiджуваних штамiв складаються iз три- тетра- та пентасахаридних лінійних або розгалужених ланцюгiв, що повторюються (рис. 3).
рис. 3 13С-ЯМР-спектри О-ПС R.solanacearum.
З застосовуванням деструктивних методiв, якi дозволили встановити тип замiщення, положення i конфiгурацiю глікозидних зв’язкiв окремих моносахаридних залишкiв, а також за допомогою метода комп'ютерного аналізу було встановлено 7 типів структур О-ПС, 6 з яких описані вперше (табл. 2).
Таблиця 2
Розподілення типів структур ланцюга, що повторюється
О-ПС дослiджуваних штамів R. solanacearum
Серед дослiджуваних штамiв значно відрізнявся від інших О-ПС шт. 8089: він побудован із лінійних трисахаридних ланцюгів, які включають 2 залишки D-рамнози та 1 залишок N-ацетилгалактозамiну.
О-ПС 7 штамів характеризувались лінійною структурою з тетрасахаридними ланцюгами, що повторюються , які складались із трьох залишків L-рамнози та одного залишка N-ацетилглюкозамiну. Вони відрізнялись між собою варіаціями у типі конфігурації глікозидного зв’язку залишку N-ацетилглюкозамiну : α - в структурах 1 i 4 та β - в структурi 2, а також позицією його прикріплення до залишку рамнози : 1→2 в структурi 1 та 1→3 в структурах 2 i 4. О-ПС із структурою 1 було визначено також японськими дослідниками Акіяма з співавт. (1985) і на початок наших досліджень це була єдина відома структура О-ПС представників цього виду.
Для більшості штамів було визначено наявність розгалужених пентасахаридних ланцюгів, основу яких складали лінійні тетрасахаридні структури 1 чи 2. Різниця стосувалась типу бічного замісника: ксилоза в структурах 3 та 5 чи рамноза в структурi 6, а також місця його прикріплення до головного ланцюга. Треба відмітити, що ксилоза являється рідкісним компонентом бактеріальних ПС і на цей час відома як складова О-ПС лише у P. maltophylia .
Для багатьох штамів було визначено наявність в складі О-ПС декількох типів структур, причому іноді різниця між штамами стосувалась лише співвідношення типів структур (див. табл. 1, група структури 3). Подiбна гетерогеннiсть була встановлена також ранiше Здоровенко з спiвавт. при вивченнi Pseudomonas syringae (1988-1991) та Солдаткiною (1989) при вивченнi О-ПС Burkholderia cepacia .
За якісним складом О-ПС досліджувані штами можна розподілити на 3 хемотипи: представники I мали у складі О-ПС L-рамнозу та N-ацетилглюкозамiн; II - крiм того ще і ксилозу; III - D-рамнозу та N-ацетилгалактозамiн.
Кореляції між структурою О-ПС і належністю штаму до певного біовару чи рослини-хазяїна або географiчної зони, з якої цей штам походить, не виявилось.
Кор -олiгосахариди.
Хоча відомо, що кор-ОГ є досить консервативною частиною молекули ЛПС, для дослiджуваних штамiв було виявлено значні варіації щодо вмісту окремих компонентів. Найбільш поширеними були рамноза та глюкоза. Але їх вміст коливався в дуже широких діапазонах : рамнози - від 1 до 81,3 %; глюкози - від 2 до 98 %. Крім цих вуглеводів у кор-ОГ більшості штамів виявлено ряд інших моносахаридів: по-перше слід відмітити галактозу, причому, для двох штамiв (шт. 8066 та 8072) вона була, разом із рамнозою, домінуючим моносахаридом, в той час, як глюкоза в них визначалась в незначнiй кількості (шт. 8072), чи була повнiстю відсутня (шт. 8066). Кор-ОГ ряду штамів мали у своєму складі ксилозу та рибозу. Визначення рибози в кор-ОГ пояснює її iдентифiкацiю при аналiзi ЛПС. Незвичайна картина моносахаридного складу спостерігалась для кор-ОГ шт.7942: 39 % манози і 31 % еритриту.
Цікавим виявився вміст в кор-ОГ досліджуваних штамів аміносполук. Крім глюкозаміну, звичайного компоненту кор-олігосахаридів багатьох видiв бактерiй, до складу кор-ОГ більшості штамів входив в досить високих концентраціях етаноламін - 0,5- 2,5%. Кор-ОГ всiх штамiв характеризувались досить постійним набором амінокислот, а саме, аланіну, гліцину та глутамінової кислоти.
Лiпiди А.
Як вiдомо, лiпiд А являється найбільш консервативною в процесi еволюцiї частиною молекули ЛПС. Лiпiди А рiзних видiв бактерiй вiдрiзняються мiж собою, в першу чергу, складом жирних кислот, який є досить стабiльним показником i використовується як один iз хемотаксономiчних критерiїв.
Для представникiв виду R. solanacearum в складi лiпiдiв А переважали жирнi кислоти з парним числов атомiв вуглецю, а саме п’ять домiнуючих компонентiв: н-тетра-, н-гексадеканова кислоти, а також 3-окситетра-, 3-оксигекса- та 3-оксиоктадеканова кислоти. Наявнiсть 3-ОН-С14:0 та 3-ОН-С16:0 у складi лiпiдiв А є характерною ознакою представникiв II рРНК-гомологiчної групи родини Pseudomonadaceae, до якої належав до недавнього часу рiд Ralstonia. Наявність 3-оксиоктадеканової кислоти можливо є однiєю з специфiчних ознак виду R.solanacearum.
РОЗДІЛ 5. БIОЛОГIЧНА АКТИВНIСТЬ ЛIПОПОЛIСАХАРИДIВ
Iмунохiмiчнi властивостi
Вiдомо, що варiацiї в структурi О-ПС лежать в основi серологiчних класифiкацiйних схем. Для виду R. solanacearum на сьогоднi такої схеми не iснує. Тому було проведено дослiдження з метою встановлення можливої кореляцiї мiж серологiчною активнiстю ЛПС та структурою його О-ПС, а також спроби з’ясування антигенної детермiнанти.
Серологічну активність ЛПС вивчали за допомогою антисироватки, отриманої до грітої бактеріальної суспензії R. solanacearum шт. 8110, ЛПС якого характеризувався наявністю тільки одного типу структури О-ПС. Цей ЛПС показав високу серологічну активність у відношенні до зазначеної антисироватки i використовувався як позитивний контроль, порівненням з яким оцінювалась активність інших антигенiв. Як негативний контроль було використано ЛПС шт. 4157, О-ПС якого за своєю структурою принципово відрізнявся від дослiджуваних:
→ 6)-α-D-GlcNAc-(1→ 4)-α-D-GalNAc-(1→
↑4
|1
β-L-Araf
i який виявився серологічно інертним до антисироватки.
За серологiчною активнiстю дослiджуванi ЛПС, вiдрiзнялась мiж собою. На рис. 4 вiдображено розподілення ЛПС досліджуваних штамів за структурним типом О-ПС та “відносну” серологічну активність, яку вони проявили при зазначених умовах тестування. Iз аналiзу цiєї дiаграми витiкає:
1. ЛПС, в структурi яких N-ацетилглюкозамiн зв’язан з залишками рамнози α- (1→2)-зв’язками (шт. 8110, 6523, 7956, 8202) являються серологiчно активними, в той час, як ЛПС iз β- (1→3)- зв’язками (шт. 767, 7942) - серологiчно iнертнi в реакцiї з використаною в дослiдженнi антисироваткою.
2. Розгалуження ланцюга лiнiйної структури i поява залишку L-ксилози як бiчного замiсника залишку рамнози (D) призводить до перетворення “неактивної“ структури 2 в таку, яка виявляє серологiчну активнiсть подiбну, а iнколи i вищу (шт. 7960, 8093, 5712, 766, 7956) за активнiсть ЛПС шт. 8110. Причому спiввiдношення кiлькостi розгалужених i лiнiйних ланцюгiв О-ПС, що входять до складу певного ЛПС (вiдповiдно, 25:75% для шт. 7960, 8093 та 70:30% для шт. 5712, 766, 7959), не має суттєвого впливу на прояв активностi антигену.
3. В той же час ксилозування залишку рамнози (D) в “активнiй” структурi 1 (шт. 8072 ) не спричинює змiн в активностi ЛПС.
4. На вiдмiну вiд ксилозування, рамнозилювання головного ланцюга “активної“ структури 1 (шт. 7944, 8277) призводить до значного падiння серологiчної активностi.
рис. 4 “Відносна” серологічна активність ЛПС R.solanacearum
Одержанi данi дозволяють зробити припущення, що суттєвим в проявi серологiчної активностi дослiджуваних ЛПС можливо є особливостi будови їх О-ПС, а саме тiєї “варiабельної“ областi ланцюга, яка складається iз залишкiв N-ацетилглюкозамiну (А) i сусiднiх з ним залишкiв L-рамнози (B) i (D). В залежностi вiд змiн хiмiчної будови цiєї областi активуються чи, навпаки, екрануються антигеннi детермiнанти ЛПС, що обумовлює прояв його серологiчної активностi (табл.3).
Таблиця3
Крім дослідження антигенної активності цілої молекули ЛПС, були проведенi аналогичні експерiменти з ліпідами А. За виключенням R. solanacearum шт. 5712, спостерiгалась кореляцiя мiж серологiчною активнiстю ЛПС i лiпiда А. Практично всi лiпiди А проявляли значно бiльшу серологiчну активнiсть, нiж вiдповiднi їм ЛПС.
Оскiльки на сьогоднi доведено, що ЛПС деяких видiв грамнегативних бактерiй проявляють досить високий рiвень iммуномодулюючої активностi, нами було проведено дослiдження iнтерфероногенної та протипухлинної активностi ЛПС R. solanacearum та його окремих структурних компонентiв.
Iнтерфероногенна активнiсть
Iнтерфероногенну активнiсть ЛПС R. solanacearum вивчали у порiвняннi до такої класичного iнтерфероногена - ЛПС E. coli 055:В5 фiрми“Sigma”.
Встановлено, що ЛПС R. solanacearum являється індуктором утворення γ-інтерферону. Iз одержаних даних (табл. 4) витiкає, що iнтерфероногенна активнiсть препаратiв ЛПС R. solanacearum та E. coli 055:В5 була аналогiчною - 530 од. Дослiдження окремих структурних компонентiв молекули ЛПС показало, що головний внесок в загальну активнiсть належить лiпiду А та кор-ОГ. Визначено також незначну (у порiвняннi до ЛПС) активнiсть фракцiї О-ПС.
Таблиця 4
Iнтерфероногенна активнiсть ЛПС та його окремих компонентiв
Протипухлинна, антилейкозна та антиметастатична активнiсть
При вивченнi протипухлинної активностi ЛПС R. solanacearum встановлено, що ЛПС пiдсилював рiст карциноми легенiв Льюїс та меланоми В-16, що виявилось в пiдвищеннi їх розмiру. Цей результат був пiдтверджений в експериментi з саркомою S-37.
При визначеннi антилейкозної активностi ЛПС встановлено, що тривалiсть життя тварин з експериментальними лейкозами пiд його впливом декiлька збiльшується. При цьому ЛПС не впливає на кiлькiсть лейкозних клiтин в асцитичнiй рiдинi (табл. 5) .
Таблиця 5
Вплив ЛПС на кiлькiсть лейкозних клiтин та продовження життя мишей ДВА2 з лiмфоцитарною лейкемiєю Р-388 i лiмфоїдною лейкемiєю L1210*
Примiтка: * Р < 0,05
Встановлено, що ЛПС проявляв виражену антиметастатичну дiю, яка виявлялась у зменшеннi об’ємів та кiлькостi метастазiв (табл. 6). Необхiдно вiдмiтити, що антиметастатичний ефект ЛПС поєднуювся з його стимуляцiйним впливом на рiст первинної пухлини.
При визначеннi антиметастатичної активностi окремих компонентiв ЛПС (табл.6), встановлено, що ЛПС та О-ПС статистично достовiрно зменшують об’єм та кiлькiсть метастазiв (на 60-70% та 40-50%, вiдповiдно). Введення мишам кор-ОГ також знижує об’єм метастазiв на 63%. Лiпiд А не проявляє статистично достовірної дiї на метастатичний процес.
Таблиця 6
Вплив ЛПС i його структурних компонентiв на кiлькiсть i об’єм (мм3) метастазiв у мишей з карциномою легенiв Льюїс*
Примiтка: * Р < 0,05
Важливим на нашу думку є виявлення iмуномодулюючих властивостей саме полiсахаридної частини молекули ЛПС. Адже основною проблемою можливого використання вiдомих на сьогоднi препаратiв бактерiального походження є високий рiвень їх пiрогенностi та токсичностi, обумовлений лiпiдною частиною ЛПС.
| 
