|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ
Лиманська Ольга Юріївна
УДК 619:578.828:57.08
РОЗРОБКА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНИХ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ РАННЬОЇ ДЕТЕКЦІЇ ВІРУСУ ЛЕЙКОЗУ ВЕЛИКОЇ РОГАТОЇ ХУДОБИ
ТА ВИЗНАЧЕННЯ СТАТІ ПРЕІМПЛАНТАЦІЙНИХ ЕМБРІОНІВ
03.00.20 – біотехнологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2001
Дисертацією є рукопис.
Роботу виконано у лабораторії повільних інфекцій Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, м. Харків.
Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН
Фукс Поліна Павлівна,
Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної
медицини УААН, м. Харків,
директор.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кор. НАН України
Малюта Станіслав Станіславович,
Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ,
зав. відділу молекулярної генетики;
доктор біологічних наук, професор
Горбатенко Ігор Юрійович,
Херсонський педагогічний університет, м. Херсон,
зав. біотехнологічного центру.
Провідна установа: Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, м. Київ.
Захист відбудеться “ 29 ” травня 2001 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143,
м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України, 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.
Автореферат розіслано 19 квітня 2001 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
кандидат біологічних наук О.В. Підпала
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Одними із важливих завдань сучасної біотехнології в галузі тва-ринництва і ветеринарної медицини є створення ефективної технології отримання тварин iз за-данними властивостями, розробка методів ранньої діагностики інфекційних та спадкових захво-рювань. Нині для вирішення цих завдань використовують молекулярно-генетичні методи, які ба-зуються на полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР). При цьому у більшості досліджень констру-ювання праймерів – основних компонентів ПЛР-тест-систем, які визначають їх специфічність, точність і надійність, – здійснюється або на основі проведення множинного вирівнювання без ура-хування термодинамічних характеристик праймерів, або на основі знання послідовності тільки од-ного ізоляту. Такий підхід до створення ПЛР-праймерів призводить до зростання кількості помил-ково негативних і помилково позитивних результатів ПЛР-аналізу.
Вирішення проблеми регуляції статі в потомстві сільськогосподарських тварин має не тіль-ки науково-теоретичне, але і практичне значення як для товарного, так і для племінного тварин-ництва. Це пов’язано з необхідністю отримувати у молочних комплексах більшу кількість телиць, а у м’ясному скотарстві – більшу кількість бичків. У зв’язку з цим актуальним є створення високо-ефективних тест-систем для визначення статі ембріонів сільськогосподарських тварин.
При масовому скринінгу у лабораторній діагностиці вірусу лейкозу великої рогатої худоби (ВЛ ВРХ) найширше використовують імуноферментний аналіз (ІФА) та реакцію імунодифузії в агарі (РІД). Однак ці методи аналізу мають ряд істотних недоліків. По-перше, це недостатньо ви-сока специфічність і чутливість. По-друге, неможливість детектувати вірус лейкозу у скритій фор-мі у молодих тварин протягом 6-12 місяців після народження, які народилися від серопозитивних корів. По-третє, тварини, які інфіковані ВЛ, з низьким або змінним рівнем антитіл чи взагалі без антитіл, специфічних до ВЛ, за допомогою цих методів важко або неможливо ідентифікувати як інфіковані ВЛ ВРХ. В той же час ці тварини можуть бути джерелом розповсюдження інфекції. То-му актуальним є створення високоспецифічних тест-систем, які дозволяють здійснювати раннє ви-явлення ВЛ ВРХ.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота пов’я-зана з плановою тематикою лабораторії повільних інфекцій Інституту експериментальної і клініч-ної ветеринарної медицини УААН “Удосконалити методи діагностики та створити засоби вакцин-ної профілактики лейкозу великої рогатої худоби“ (1997-2000 рр., № держреєстрації 0197V000756) та науково-технічною програмою Української академії аграрних наук “Ветеринарне забезпечення” – Системи захисту сільськогосподарських тварин від захворювань та створення нових лікувально-профілактичних засобів (1996-2000 рр., № держреєстрації 03.04-МВ/19-96). Автор є одним із від-повідальних виконавців молекулярно-біологічної частини програм, співавтором розроблених та
запатентованих тест-систем для детекції вірусу лейкозу великої рогатої худоби та визначення статі
ембріонів.
Мета і завдання дослідження. Метою дослідження була розробка молекулярно-генетичних тест-систем для ранньої детекції ВЛ ВРХ за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, а також для визначення статі преімплантаційних ембріонів сільськогосподарських тварин шляхом детекції Y-специфічного SRY-гена та їх мультилокусного аналізу.
Об’єктом дослідження є широко розповсюджене у світі захворювання великої рогатої худо-би – лейкоз та тварини із заданими ознаками – трансгенні тварини.
Предмет дослідження – молекулярно-генетичні тест-системи для раннього виявлення інфек-ційного збудника лейкозу, а також для детекції статі преімплантаційних ембріонів сільськогоспо-дарських тварин.
Зважаючи на існуючий стан проблеми, передбачалось вирішення таких завдань:
- Створення систем праймерів зі 100 %-им рівнем специфічності для здійснення ранньої
детекції провірусної ДНК ВЛ ВРХ за допомогою ПЛР та теоретичне порівняння з іс-
нуючими ПЛР-тест-системами.
- Розробка системи праймерів зі 100 %-им рівнем специфічності для проведення ПЛР для визначення статі ембріонів великої рогатої худоби.
- Розробка універсальної системи праймерів для визначення статі ембріонів сіль-ськогосподарських тварин – великої рогатої худоби, вівці, кози та свині.
- Розробка критеріїв якості та методів оцінки ПЛР-тест-систем для молекулярно-гене-тичних досліджень.
- Експериментальне випробування створених систем праймерів для проведення одно-раундової та двораундової ПЛР-детекції ДНК провірусу лейкозу ВРХ та визначення ста-ті преімплантаційних ембріонів великої рогатої худоби.
- Експериментальне порівняння створених та існуючих тест-систем для ПЛР-детекції ві-
русу лейкозу великої рогатої худоби.
- Створення тест-системи для мультиплексної ПЛР-детекції у геномі преімплантаційних
ембріонів вірусу лейкозу та визначення статі преімплантаційних ембріонів.
У роботі використані сучасні молекулярно-генетичні та біологічні методи досліджень нук-леїнових кислот, а також теоретичний аналіз секвенованих послідовностей нуклеїнових кислот із баз даних EMBL, GenBank, DDBJ.
Для ампліфікації та детекції фрагментів генів використовували полімеразну ланцюгову ре-акцію та електрофорез в агарозному гелі. Для виділення лімфоцитів із периферичної крові вико-ристовували центрифугування у градієнті густини. Для рестрикції нуклеїнових кислот та їх нас-тупної очистки застосовували ферментативну обробку рестриктазами, очистку з органічними роз-чинниками та рідинну хроматографію. Вимірювання концентрації нуклеозидтрифосфатів та ДНК виконували за допомогою УФ-спектроскопії. Комп’ютерний аналіз (множинне вирівнювання, ста-тистичний аналіз множинного вирівнювання, швидкий пошук гомології за базою даних, пошук функціональних сайтів, філогенетичний аналіз та побудова вторинної структури амплікону) було проведено за допомогою ліцензійного пакету прикладних програм для молекулярної біології GeneBee. Для відбору системи праймерів з урахуванням їх термодинамічних характеристик вико-ристовували комп’ютерний аналіз за допомогою програми Oligo.
Наукова новизна одержаних результатів. Всі наведені в роботі дані одержані автором вперше.
Показано, що ключовим параметром, який визначає специфічність, точність і надійність ПЛР-аналізу, є ступінь гомології праймерів.
Для існуючих ізолятів ВЛ ВРХ виявлено висококонсервативні фрагменти гена env зі 100 %-им рівнем специфічності.
Створено нову тест-систему для ПЛР з наборами праймерів для гена env, які характеризу-ються 100 %-им рівнем специфічності та дозволяють здійснювати раннє виявлення ВЛ ВРХ з точ-ністю, наближеною до 100 %.
Розроблено та випробовано систему ПЛР-праймерів для визначення статі ембріонів великої рогатої худоби зі 100 %-ою специфічністю на основі Y-специфічного гена SRY.
Для вирішення проблеми регуляції статі в потомстві сільськогосподарських тварин скон-
струйовано універсальну систему ПЛР-праймерів, яка дає змогу визначати стать преімплантацій-
них ембріонів великої рогатої худоби, кози, вівці зі 100 %-ою специфічністю, а ембріонів свині – з 96 %-ою специфічністю.
Створено та випробовано системи праймерів для проведення однораундової та двораун-дової ПЛР-детекції ВЛ ВРХ та визначення статі.
Запропоновано тест-систему для мультиплексної ПЛР-детекції вірусу лейкозу в геномі пре-імплантаційних ембріонів та визначення статі ембріонів.
Проведено теоретичне та експериментальне порівняння створених ПЛР-тест-систем для де-текції ВЛ ВРХ та визначення статі великої рогатої худоби з існуючими. Показано, що створені на-бори праймерів характеризуються більш високою специфічністю, а отже, і точністю на відміну від тих, що використовуються у біотехнологічній практиці та ветеринарній медицині.
На основі гена α-лактальбуміну створено систему праймерів для внутрішнього контролю ампліфікації, яка може бути використана при проведенні ПЛР-аналізу геному не тільки ВРХ, а й кози.
Практичне значення одержаних результатів. В Україні останнім часом, незважаючи на вжиті заходи, актуальною залишається проблема боротьби (діагностики, профілактики, лікування) з лейкозом великої рогатої худоби та іншими повільними інфекціями сільськогосподарських тварин. У країнах із високим рівнем розвитку тваринництва та репродуктивної біотехнології існу-ють наукові програми з викоренення розповсюджених небезпечних інфекційних захворювань. В основі таких програм лежать молекулярно-біологічні методи раннього виявлення інфекційних збудників – етіологічних агентів цих захворювань.
Розроблені у даній роботі молекулярно-генетичні тест-системи для детекції ВЛ ВРХ за до-помогою сучасного методу аналізу – полімеразної ланцюгової реакції – є науковою основою такої програми ліквідації лейкозу в Україні.
В той же час розроблені підходи можуть бути з успіхом використані при створенні тест-сис-тем для ПЛР-детекції будь-яких інфекційних захворювань вірусної, бактеріальної, грибкової етіо-логії, в тому числі і для виявлення таких нових для України збудників повільних інфекцій, як, на-приклад, вірус імунодефіциту великої рогатої худоби.
Розроблені тест-системи для ПЛР-детекції ВЛ ВРХ дозволяють вирішити проблему ство-рення методу раннього виявлення сільськогосподарських тварин, інфікованих ВЛ, тобто тварин-вірусоносіїв із низьким рівнем або без антитіл до ВЛ ВРХ, які можуть бути джерелом розпо-всюдження інфекції і не можуть бути виявлені традиційними методами діагностики – реакцією імунодифузії та імуноферментним аналізом.
Конструювання тест-системи для визначення статі преімплантаційних ембріонів сіль-ськогосподарських тварин є першим кроком у створенні в Україні трансгенних тварин із заданими ознаками.
Застосування серологічних методів діагностики лейкозу разом із профілактичними захода-ми дозволяє значно зменшити ступінь ураженості господарств лейкозом і навіть ліквідувати його. Однак тривалі спостереження показують, що через 3-4 роки після оздоровлення стад у деяких із них знову з’являються хворі тварини, тобто оздоровчі заходи не закінчуються повним викорі-нюванням захворювання. Зважаючи на це, отримані результати можуть бути використані при про-веденні заходів із повного викорінювання лейкозу в тваринницьких господарствах України внаслі-док раннього виявлення тварин-носіїв ВЛ ВРХ, які принципово не можуть бути детектовані тради-ційними методами детекції, а також на завершальному етапі при проведенні робіт із оздоровлення господарств від лейкозу. Впровадження полімеразної ланцюгової реакції як методу ранньої моле-кулярної діагностики в практику і використання запропонованих тест-систем дозволить істотно підвищити якість і надійність кінцевих результатів. Сконструйована універсальна система прай-мерів для визначення статі ембріонів сільськогосподарських тварин може знайти застосування при вирішенні проблеми довільної регуляції статі в племінному скотарстві, створенні стад маточного поголів’я, а також при трансплантації ембріонів, їх клонуванні, генній трансформації. Результати дисертаційної роботи використовують у Харківському НДІ мікробіології та імунології ім. І.І. Меч-никова у формі рекомендацій та розроблених методик.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто було проведено аналітичний огляд лі-тературних даних та отримано експериментальні результати, наведені в рукопису. Теоретичні ре-зультати отримано здобувачем особисто або за безпосередньої участі при виконанні комп’ю-терного аналізу. Обговорення та аналіз результатів проведено спільно з науковим керівником. Ди-сертаційну роботу виконано у тісному співробітництві з академіком УААН, д.в.н. Бусолом В.О. (Національний аграрний університет, м. Київ); д. с.-г. н., професором Безуглим М.Д. (Інститут тваринництва, м. Харків); к.б.н. Лиманським О.П. (НДІ мікробіології та імунології ім. І.І. Меч-никова, м. Харків), з якими автор має спільні публікації.
Автор висловлює щиру подяку академікові УААН, д.в.н., професорові Фукс П.П. за по-стійну підтримку, плідне обговорення та корисні зауваження.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались на між-народній науково-практичній конференції “Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми” (м. Харків, 1997); на науково-практичному семінарі “Лабораторна ветеринарна медици-на: фізико-хімічні методи досліджень” (м. Рівне, 1998); на ІІ Міжнародній конференції “Вико-ристання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (м. Одеса, 1998); на 32-ій щорічній конференції товариства із вивчення відтворення (Society for Study of Reproduction) (м. Вашингтон, США, 1999); на ІІІ Міжнародній конференції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селек-ційних дослідженнях ” (м. Одеса, 1999); на Всеукраїнському семінарі-нараді “Стан реалізації ос-новних заходів щодо оздоровлення великої рогатої худоби від лейкозу в господарствах України на 1996-2000 рр.” (м. Полтава, 2000).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 роботи у фахових наукових журна-лах, 4 – у журналах і збірниках наукових праць та тези 3 доповідей, отримано два рішення про ви-дачу патентів.
Структура та обсяг роботи. Дисертацію викладено на 120 сторінках машинописного тексту та оформлено у відповідності з вимогами ВАК України. Вона складається із переліку умов-них позначень, символів, одиниць, скорочень і термінів, вступу, п’яти розділів, висновків, списку використаних джерел, який охоплює 172 найменування, додатків. Дисертацію проілюстровано 15 рисунками та 19 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Для аналізу секвенованих послідовностей нуклеїнових кислот із баз даних EMBL та GenBank використовували пакет прикладних програм GeneBee. Необхідні для створення ПЛР-тест-систем швидкий пошук гомологій по банках, множинне вирівнювання з наступним ста- тистичним аналізом виконували за допомогою модулів Quick Search, Ma-Tools і Statalign пакету GeneBee. Для відбору ПЛР-праймерів з урахуванням їх термодинамічних характеристик засто-совували програму Oligo. Для одержання інформації про схожість послідовностей фрагментів ге-нів, з точки зору еволюційного розвитку, відповідних видів тварин були сконструйовані філогене-тичні дерева з використанням модуля Tree пакету GeneBee. Клінічним матеріалом для ПЛР були: 1) зразки периферичної крові ВРХ та овець, експериментально інфікованих вірусом лейкозу, а та-кож зразки крові ВРХ з господарств Харківської області; 2) 7-8-денні ембріони ВРХ. Амплі-фікацію проводили з використанням ПЛР з гарячим стартом. Для візуалізації продуктів ампліфі-кації застосовували метод горизонтального електрофорезу в агарозному гелі. Як маркер молеку-лярної ваги використовували ДНК бактеріофага λ, оброблену рестриктазами Hind III, EcoRV та EcoRI. Як позитивний контроль при детекції ВЛ ВРХ використовували культуру клітин нирки ем-бріонів вівці, інфіковану ВЛ ВРХ, а також плазміду pBLV344, яка містила провірусну ДНК вірусу лейкозу ВРХ.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Детекція вірусу лейкозу великої рогатої худоби
Головною проблемою розробки методів детекції ретровірусів, заснованих на ПЛР, є висока мінливість генетичного матеріалу інфекційних агентів, зокрема вірусів, а також необхідність ви-значення консервативних послідовностей у його структурних або регуляторних генах і вдалий під-бір праймерів до них.
Оскільки праймери є ключовими елементами, які визначають специфічність, чутливість, точність та надійність ПЛР, було удосконалено основні принципи створення наборів праймерів для ПЛР-детекції:
- Праймери повинні обмежувати фрагмент нуклеїнової кислоти довжиною не менше
ста пар основ, що пов’язано з подальшою візуалізацією ампліфікованого фрагмента за
допомогою електрофорезу в агарозному гелі.
- Необхідність збільшення довжини праймера з метою підвищення специфічності ПЛР, а
отже, точності та надійності аналізу.
- Ступінь гомології праймерів повинен бути максимально високим, внаслідок чого буде знижено відсоток помилково позитивних та помилково негативних результатів ПЛР-аналізу.
- Вибір оптимальної температури плавлення (і отже, температури відпалу) праймера з урахуванням ступеня гомології з метою запобігання появи додаткових ампліконів.
- Відсутність у праймерів та у продуктів ПЛР самокомплементарних ділянок і компле-
ментарних фрагментів між праймерами.
6. Необхідність внутрішнього контролю ампліфікації.
Першим етапом створення системи праймерів для ПЛР-детекції ВЛ ВРХ був пошук консер-вативних ділянок у геномах ізолятів ВЛ із високим ступенем гомології. Для комп’ютерного аналі-зу було створено підбазу гена env відомих ізолятів ВЛ ВРХ із баз даних EMBL та GenBank. Знай-дено оптимальні параметри пошуку мотивів та множинного вирівнювання для восьми і більше фрагментів гена env з метою виявлення висококонсервативних ділянок зі 100 %-им рівнем гомо-логії. Фрагменти результатів статистичного аналізу проведеного множинного вирівнювання наве-дено на рис. 1, 2.
Рис. 1. Фрагмент комп’ютерного аналізу ізолятів гена env ВЛ ВРХ із баз даних EMBL
та GenВank, проведеного за допомогою пакету прикладних програм GeneBee.
Чорні смуги під послідовностями вказують на ділянки гена env ВЛ ВРХ зі
100 %-им рівнем гомології для всіх відомих варіантів ВЛ ВРХ. BLV3 – один із
створених праймерів.
Термін “100 % рівень гомології” тут і далі означає, що для всіх відомих ізолятів (тобто для тих, які присутні у базах даних EMBL, GenBank, DDBJ) на момент проведення комп’ютерного аналізу ступінь гомології дорівнює 100 %. В той же час є вірогідність, що існують варіанти ВЛ ВРХ, секвенс яких невідомий, або з часом буде секвеновано ізоляти гена env ВЛ ВРХ, для яких ступінь гомології визначених нами фрагментів гена env буде меншим, ніж 100 %.
Рис. 2. Фрагмент комп’ютерного аналізу ізолятів гена env ВЛ ВРХ із баз даних EMBL
та GenВank. ZM3 – праймер для детекції ВЛ ВРХ, сконструйований у Національ-
ному інституті ветеринарії Польщі. Провали на чорних смугах демонструють не-
досконалість праймерів: для одного або декількох ізолятів у даній позиції є нук-
леотиди, які не збігаються з нуклеотидами інших ізолятів. Помилкові (некомп-
лементарні) позиції у ізолятів та праймерів показано маленькими літерами.
На другому етапі за допомогою програми Oligo з цих висококонсервативних фрагментів ге-на env методом ітерацій були визначені праймери BLV1-4, послідовності яких наведено у табл. 1. Усі праймери BLV1-4 мають 100 %-ий ступінь гомології, і отже, 100 %-ву специфічність, що обумовлює надзвичайно високу точність та чутливість ПЛР при її використанні для детекції ін-фекційних збудників. Праймери BLV1-4 було сконструйовано з урахуванням можливості прове-дення гніздової ПЛР.
Аналіз температур плавлення праймерів показав, що наявність одного помилкового (не-
спареного) нуклеотида у комплексі праймер-однонитковий продукт ПЛР призводить до зниження температури відпалу Тan приблизно на 4 оС, двох неспарених нуклеотидів – на 8 оС і т.д. З експе-риментальних досліджень плавлення нуклеїнових кислот відомо, що ширина плавлення ΔТ корот-ких олігонуклеотидів довжиною 20-40 нуклеотидів (якими є праймери для ПЛР-детекції) стано-вить ~ 10 оС. Це означає, що праймер буде відпалюватися на ампліконі, і продукт реакції буде синтезуватися за умови правильного вибору Тan за наявності не більше двох неспарених нуклеоти-
Таблиця 1
Послідовності сконструйованих нами праймерів для детекції ДНК провірусу лейкозу ВРХ за допомогою полімеразної ланцюгової реакції
дів у комплексі праймер-однонитковий амплікон.
Експериментальне порівняння різних наборів праймерів для ПЛР-детекції прові-русної ДНК ВЛ ВРХ було проведено на лімфоцитах крові биків. Практично повний збіг результатів чотирьох серій досліджень для биків 6-місячного віку з набором праймерів BLV3-BLV4 свідчить про достовірність ПЛР-аналізу зі створеним набором праймерів. Вибіркове тестування цих же зразків з наборами внутрішніх праймерів OBLV11-OBLV12 (які було створено у Національному інституті ветеринарії Швеції) підтвердило більш низьку чутливість цих праймерів порівняно із створеними нами. Результати ПЛР-детекції ВЛ ВРХ у лімфоцитах 9-місячних бичків з наборами праймерів BLV3-BLV2 та BLV1-BLV4 також повністю збігаються.
Таким чином, ці експериментальні дані (і) є наочною демонстрацією того, що створені ком-бінацією праймерів BLV1-4 чотири набори праймерів можна використовувати як незалежні тест-системи для виявлення ВЛ ВРХ; (іі) свідчать про те, що сконструйовані нами тест-системи мають більш високі точність та специфічність порівняно з існуючими аналогами.
Визначення статі преімплантаційних ембріонів
сільськогосподарських тварин
Для конструювання універсальної тест-системи для детекції статі преімплантаційних ем-
бріонів сільськогосподарських тварин на першому етапі нами було побудовано дендрограму для SRY-гена різних видів тварин. Аналіз філогенетичного дерева, наведеного на рис. 3, показав близ-кість розташування SRY-гена ВРХ, вівці, кози в той час, як SRY-ген свині та особливо коня ево-люційно дещо віддалений від SRY-гена тварин родини Bovidae. З урахуванням цього було скон-струйовано універсальну систему праймерів SRY1-4 згідно з вище сформульованими принципами створення ПЛР-тест-систем.
Рис. 3. Філогенетичне дерево SRY-гена шести видів сільськогосподарських тварин.
Шкала вказує приблизні філогенетичні відстані. В дужках наведено ізоляти із
EMBL та GenBank, для яких було побудовано дендрограму.
На рис. 4 наведено фрагмент комп’ютерного аналізу SRY-гена основних видів сільськогос-подарських тварин, з якого було обрано один із праймерів (SRY1) нашої тест-системи.
Набори праймерів BLV1-BLV2 та SRY1-SRY3 дозволяють ампліфікувати фрагмент довжи-ною 516 та 310 пар основ відповідно, і, завдяки коректному вибору температур відпалу, можуть бути використані для мультиплексної ПЛР для одночасного визначення статі та детекції ВЛ ВРХ. Наявність високого ступеня гомології праймерів є необхідною, але недостатньою умовою високо-якісної ПЛР-тест-системи. Утворення вторинної структури однонитковим ампліконом у процесі переходу від денатурації ПЛР-продукту до етапу відпалу праймерів за рахунок існування палін-дромних ділянок у середині амплікону може ускладнювати відпал праймера на ПЛР-продукті і, от-же, бути однією з причин помилково негативного результату ПЛР. Проведений аналіз показав, що створені нами праймери для ПЛР-детекції статі містять для їхнього відпалу або однониткові ді-лянки, або двониткові фрагменти, які характеризуються високими значеннями свободної енергії
| 
