|
УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК
ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА
Щербак олена валентинівна
УДК 636.22/.28:636.4:57.08
Порівняльний аналіз ооцитів, яйцеклітин та ембріонів великої рогатої худоби і свині, що були отримані в умовах in vivo та in vitro
03.00.20 - біотехнологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата сільськогосподарських наук
ХАРКІВ - 2001
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у відділі біотехнології відтворення і генної інженерії Інституту тваринництва УААН та лабораторії генної інженерії Харківського біотехнологічного центру УААН і Міністерства освіти і науки.
Науковий керівник
доктор сільськогосподарських наук,
старший науковий співробітник
Безуглий Микола Дмитрович,
науковий директор Інституту
тваринництва УААН
Офіційні опоненти :
доктор біологічних наук, професор Шахбазов Валерій Гайович, Харківський національний університет, завідувач кафедри генетики і цитології
кандидат сільськогосподарських наук Скляров Павло Миколайович, Харківський зооветеринарний інститут Міністерства аграрної політики України, асистент кафедри розведення та відтворення сільськогосподарських тварин
Провідна установа:
Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок Міністерства аграрної політики України,
м. Львів
Захист дисертації відбудеться ‘’24 ‘’квітня 2001 р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 65.356.02 при Інституті тваринництва УААН за адресою: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту тваринництва УААН за адресою 62404, Харківська обл., Харківський р-н., п/в Кулиничі
Автореферат розісланий ‘’22’’березня 2001 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат сільськогосподарських наук Чалий О.І.
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Останні роки характеризуються пильною увагою до проблем біології розвитку, які хвилюють як біологів, що намагаються розкрити механізми диференціації та розвитку організму, так і біотехнологів, практичні потреби яких вимагають як можливо більш глибоких знань ембріонального періоду розвитку сільськогосподарських тварин. Необхідність повної інформації про передімплантаційний період розвитку обумовлена тією обставиною, що навіть в умовах in vivo має місце загибель значної кількості зигот та зародків (Anderson L.L, 1974; Эрнст Л.К., Сергеев Н.И., 1989, Эрнст Л.К., Жигачев А.И., 1990, Стефанович А.В., Бариляк И.Р., 1994). На думку дослідників, близько 5-10% усіх тільних корів мають зиготу з хромосомними аномаліями (Weisner E., Willer H., 1981). А у не зовсім адекватних умовах in vitro загибель зародків, можливо, зростає.
У біотехнології все більш широке застосування знаходить метод запліднення яйцеклітин та культивування ембріонів поза організмом. Оскільки умови in vitro не адекватні фізіологічним процесам, які супроводжують дозрівання ооцитів, запліднення яйцеклітин та дроблення ембріонів в організмі тварин, можливо очікувати, що це накладає свій відбиток на стан яйцеклітин та ембріонів, хоча удосконалення методів та умов культивування проходить постійно (Prichard J.F., Pool S.H., 1991; Choi Y. et al., 1991; Морено М.В., 1992; Van Inzen W.G. et al., 1993; Chung B.H.et al., 1994; Лебедева И.В. и др., 1995; Лобачьова І.В.. 1996; Жернокльов Г.В., 1998). Однак досліджень, спрямованих на вивчення стану хромосомного апарату цих яйцеклітин та ембріонів, дуже мало (Iwasaki S., Nakahara T., 1990; Yadaw B.R. et al., 1991; Iwasaki S. et al., 1992). Не проводилось також комплексного порівняльного аналізу гамет та ембріонів, які отримані в умовах in vitro, між декількома видами тварин.
Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Наукові дослідження проводилися в рамках тематичного плану Інституту тваринництва УААН та Харківського біотехнологічного центру. Здобувач був виконавцем по темам “Розробити біотехнологічні методи створення сільськогосподарських тварин з заданими господарсько-корисними ознаками (№ держреєстрації 0196U011388) та “Розробити метод кріоконсервації ембріонів свиней” (№ держреєстрації 0196U011390).
Мета та завдання досліджень. Метою роботи було порівняння морфології та стану хромосомного апарату жіно чіх гамет (ооцитів, яйцеклітин) та ембріонів великої рогатої худоби і свині, які були отримані в умовах організму та поза ним. Для досягнення поставленої мети вирішувались такі завдання:
1. Вивчити кінетику мейоза в ооцитах корів та свиней при культивуванні in vitro за методикою, яку використовували у відділі біотехнології відтворення та генної інженерії ІТ УААН.
2. Вивчити вплив індивідуальних якостей ооцитів на ефективність їх дозрівання поза організмом.
3. Провести цитогенетичний аналіз ооцитів та яйцеклітин великої рогатої худоби і свині, що дозріли в умовах in vivo та in vitro.
4. Вивчити можливі аномалії яйцеклітин та зигот корів і свиней у процесі запліднення in vitro.
5. Порівняти ранні ембріони великої рогатої худоби та свиней, які були отримані поза організмом.
- Порівняти хромосомний апарат ембріонів корів, що отримані у природних фізіологічних умовах організму та поза ним.
Об’єкт дослідження: ооцити, яйцеклітини і ембріони великої рогатої худоби та свині, що були отримані в умовах in vivo та in vitro.
Предмет дослідження: порівняння стану морфології та хромосомного апарату жіночіх гамет та ембріонів великої рогатої худоби і свині в процесах гаметогенезу та раннього ембріогенезу в умовах in vivo та in vitro.
При виконанні роботи використовували біотехнологічні методи (виділення ооцитів із яєчників тварин, культивування ооцитів та ембріонів поза організмом), морфологічні (оцінка ооцитів, яйцеклітин та ембріонів за морфофізіологічними показниками) та цитогенетичні (для виявлення аномалій хромосомного апарату) методи досліджень. Обробку числового матеріалу проводили методами статистичного аналізу.
Науковою новизною отриманих результатів є комплексний підхід при порівнянні ооцитів, яйцеклітин та ембріонів великої рогатої худоби і свині, отриманих в умовах in vivo та in vitro.
Вивчені особливості тривалості першого мейотичного ділення в ооцитах великої рогатої худоби та свині, які культивували поза організмом.
В роботі вперше було проведено цитогенетичний порівняльний аналіз ембріонів корів з ембріонами свині, які були отримані в умовах in vitro.
Висунута гіпотеза про різні механізми дегенерації ембріонів, які були отримані в умовах організму та поза ним.
Практичне значення отриманих результатів. Отримані дисертантом дані про кінетику мейозу були використані в дослідах по ембріональному клонуванню великої рогатої худоби у відділі біотехнології відтворення та генної інженерії ІТ УААН.
В Інституті свинарства УААН в дослідах по культивуванню ооцитів та заплідненню яйцеклітин свині були використані середовища для культивування ооцитів, оптимізовані здобувачем, а також дані, отримані дисертантом про хронологію подій першого мейотичного ділення в ооцитах свині. Дані, що отримав дисертант, також були використані у курсах лекцій з біотехнології, генетики та біології розвитку сільськогосподарських тварин у Харківському зооветеринарному інституті. Отримані дані про хронологію подій першого мейотичного ділення в ооцитах корів та свиней можуть бути використані при постановці дослідів по заплідненню яйцеклітин поза організмом та кріоконсервації ооцитів різних стадій зрілості.
Теоретична цінність роботи полягає у встановленні деяких причин та можливого механізму ранньої ембріональної смертності сільськогосподарських тварин.
Особистий внесок здобувача полягає в проведенні експериментальних досліджень з теми дисертації, опрацюванні першоджерел літератури, аналізі та інтерпретації одержаних результатів, статистичній обробці результатів досліджень. Методологічні підходи та схема досліджень були розроблені разом з науковим керівником. Із загальних наукових експериментів та публікацій дисертант використав тільки свою частину результатів.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на конференціях молодих вчених та спеціалістів (Харків, 1996; 1998); на Міжнародній науково-виробничій конференції “Теорія та практика племінного діла в тваринництві” (Харків, 1996); на Міжнародній науково-виробничій конференції “Використання трансплантації ембріонів в селекції і відтворення сільськогосподарських тварин” (Асканія -Нова, 1997); на Міжнародній науково-виробничій конференції “Сучасні проблеми ветеринарної медицини, зооінженерії, технологій продуктів тваринництва з нагоди 100-річчя від часу надання Львівській академії ветеринарної медицини ім`я С.З.Гжицкого“ (Львів, 1997); на ІІ та ІІІ Міжнародній конференції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (Одеса, 1998, 1999) та на міжнародній конференції, присвяченій 50-річчю перших успішних пересадок ембріонів свині і 100-річчю з дня народження автора цієї розробки – О.В. Квасницького (Київ, 2000).
Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено у 6 друкованих працях. У тому числі в 4 статтях у фахових виданнях, затверджених ВАК України та 2 тезах доповідей науково-практичних конференцій.
Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 130 сторінках машинописного тексту, вміщує 15 таблиць та 23 рисунки. Список літератури складається з 187 джерел, у тому числі 128 на іноземних мовах.
Матеріал та методика досліджень
Дослідження проводились в Інституті тваринництва УААН та Харківському біотехнологічному центрі. Робота виконана з 1994 по 1999 рік.
Яйцеклітини, що дозрівали в умовах in vivo, отримували із яєчників тварин методом аспірації передовуляторних фолікулів. Ембріони ранніх стадій отримували промиванням яйцеводів та рогів матки, після забою тварин. Отримання ембріонів тварин більш пізніх стадій проводили на 7-8 день статевого циклу нехірургічним способом.
Яєчники тварин брали на Харківському м’ясокомбінаті та на бойні д/г “Українка”. В дослідах по вивченню впливу індивідуальних якостей ооцитів на ефективність їх дозрівання поза організмом об’єм яєчників вимірювали за допомогою мірного циліндру. Ооцит-кумулюсні комплекси (ОКК) отримували методом насічок яєчників корів та свиней. В дослід відбирались ОКК з щільним компактним кумулюсом та гомогенною ооплазмою. Для дозрівання ОКК корів використовували середовище ТСМ-199 з 10% фетальної телячої сироватки та гормональними добавками. В середовище для дозрівання ооцитів свиней, крім перелічених компонентів, додавали 5-10% свинячої фолікулярної рідини. Яйцеклітини корів запліднювали заморожено-відталою спермою, попередньо капацитованою гепарином та культивували в середовищі ТСМ-199 з 20% фетальної телячої сироватки, а яйцеклітини свиней запліднювали свіжоотриманою спермою, також попередньо капацитованою, та культивували у модифікованому середовищі Віттена.
Цитогенетичний аналіз проводили після фарбування 1% ацетогематоксиліном під світловим мікроскопом Axiovert -35.
Результати досліджень
Кінетика мейозу в ооцитах корів та свиней при культивуванні поза організмом
Відомо, що тривалість мейозу, який складає основну частину процесу дозрівання ооцитів, та його стадій у ссавців видоспецифічна. Крім того, за даними різних авторів, в умовах in vitro, вона дуже коливається як для корів, так і для свиней (Suss U. et al., 1988; Betancourt M. et al., 1993; Yoshida M. et al., 1993). Тому нами була вивчена часова послідовність стадій мейозу в ооцитах корів та свиней при культивуванні поза організмом в оптимізованих нами умовах (табл.1-2).
Таблиця 1
Кінетика мейозу в ооцитах корів, які культивували поза організмом
*- Усі значення вказані в відсотках від кількості досліджених ооцитів у цей проміжок часу.
а - Р< 0,001
Таблиця 2
Кінетика мейозу в ооцитах свині, які культивували поза організмом
*- Усі значення вказані в відсотках від кількості досліджених ооцитів у цей проміжок часу.
а -Р< 0,05
Таким чином, нами було встановлено, що перше мейотичне ділення в ооцитах свиней займає майже у два рази більше часу ніж цей процес в ооцитах корів. В ооцитах корів він складає 24-26 годин, а в ооцитах свиней 42-44 години. Тому запліднення яйцеклітин поза організмом цих видів тварин необхідно проводити у ці проміжки часу.
Вплив індивідуальних якостей ооцитів на ефективність їх дозрівання поза організмом
Першим етапом біотехнології культивування ембріонів поза організмом є дозрівання ооцитів з метою отримання повноцінних яйцеклітин. На цьому етапі ооцити отримують, як правило, із групи яєчників. Тому при низькому рівні дроблення зигот не можливо точно визначити причини, які його визвали тому, що це може бути обумовлено або впливом індивідуальних якостей ооцитів або ж умовами дозрівання. Нами були проведені експерименти по культивуванню ооцитів із окремих яєчників для з`ясування можливого впливу їх індивідуальних властивостей на дозрівання поза організмом. Для наведення та більшої наочності отриманих результатів ми об`єднали яєчники у три групи за їх об`ємом. У кожній групі ми виділили дві підгрупи: яєчників з жовтим тілом та без нього. В табл. 3-4 наведена середня ефективність дозрівання ооцитів свиней та корів поза організмом із окремих яєчників.
Так, середня кількість ооцитів з щільним компактним кумулюсом, отриманих із яєчників свиней об`ємом 12-16 мл з жовтим тілом, було достовірно нижче (Р<0,01), ніж кількість таких ооцитів, які були отримані із яєчників об`ємом 8-12 мл. Також достовірно нижче (Р< 0,001) була доля повноцінних яйцеклітин, отриманих при дозріванні ооцитів із яєчників об`ємом 8-12 мл без жовтого тіла, у порівнянні з долею яйцеклітин, отриманих із яєчників свині об`ємом 12-16 мл з жовтим тілом.
Таблиця 3
Середня ефективність дозрівання ооцитів свині поза організмом із
окремих яєчників
* - Р < 0,001; а - Р < 0,001
А середня кількість ооцит-кумулюсних комплексів з щільним компактним кумулюсом, отриманих із яєчників корів об`ємом 8-12 мл була достовірно нижча ніж середня кількість таких ооцит-кумулюсних комплексів із яєчників об`ємом 15-19 мл без жовтого тіла.
Таблиця 4
Середня ефективність дозрівання ооцитів корів поза організмом із
окремих яєчників
* - Р < 0,001; а - Р < 0,001
Також достовірно нижче була доля яйцеклітин, які дозріли із ооцитів, отриманих із яєчників об`ємом 8-15 мл, у порівнянні з долею яйцеклітин, які дозріли із ооцитів, отриманих із яєчників об`ємом 15-19 мл.
Таким чином, можливо зробити висновок, що ооцити корів, отриманні із яєчників корів об`ємом 15-19 мл без жовтого тіла, та ооцити свиней, отримані із яєчників об`ємом 12-16 мл, але які мають жовте тіло, володіють більш високою ефективністю дозрівання.
Порівняльний аналіз ооцитів корів та свиней, які були отримані в різних умовах культивування
Багато спадкових захворювань обумовлено хромосомними та геномними мутаціями, які виникають в статевих клітинах у процесі гаметогенезу навіть в природних умовах організму. У неадекватних умовах культивування частота з`явлення цих аномалій, можливо, зростає. Тому нами було проведено аналіз ооцитів, які дозрівали в яєчниках (in vivo) та тих, які дозрівали поза організмом.
Ооцити свиней та корів, що дозріли в природних фізіологічних умовах, ми отримували методом аспірації із передовуляторних фолікулів яєчників. Нами було отримано 52 яйцеклітини корів і 60 яйцеклітин свиней (табл.5). Серед них з метафазними пластинками (МІІ) без аномалій було 46,2% та 81,7% яйцеклітин корів та свиней, відповідно.
Таблиця 5
Порівняльний аналіз яйцеклітин корів та свиней, отриманих в умовах
in vivo та in vitro
а - доля від загальної кількості жіночих гамет
Із яєчників забитих тварин було отримано 255 ооцитів корів та 265 ооцитів свині на різних стадіях розвитку. Потім нами було відібрано 120 ооцитів корів та 130 ооцитів свиней, придатних до наступного культивування. Після їх дозрівання у культурі до метафази ІІ було проведено цитогенетичний аналіз. Було встановлено, що тільки 34,2% яйцеклітин корів та 34,4% яйцеклітин свиней від початково видалених з яєчників ооцитів мали нормальний набір хромосом на МІІ мейозу.
При морфологічному аналізі (табл.6) видалених з передовуляторних фолікулів яєчників ооцитів було виявлено, що їх можна розділити на два типи: ооцити з ослизненим кумулюсом (ооцити з повністю експандованим кумулюсом, який представлений желеподібною речовиною, з темними включеннями) та ооцити з розпушеним кумулюсом. Ооцити другого типу за своєю морфологією були подібні до ооцитів, які досягли другої метафази мейозу при культивуванні поза організмом.
Таблиця 6
Аналіз ооцитів, отриманих із передовуляторних фолікулів яєчників
корів та свиней
* - Р< 0,05
При порівнянні ооцитів, нами було виявлено, що кількість ооцитів з ослизненим кумулюсом, отриманих із яєчників корів, була вірогідно вища, ніж кількість таких же ооцитів, отриманих із яєчників свиней. Усі аспіровані нами ооцити з розпушеним кумулюсом знаходились на стадії телофази І - метафази ІІ мейозу і ніяких аномалій у них не знайдено. При проведені цитологічного аналізу ооцитів з ослизненим кумулюсом було встановлено, що їх хромосоми в більшості випадків були повністю або частково дегенеровані, хоча зустрічалися ооцити з нормальною ТІ- МІІ.
Аналізуючи ооцити корів та свиней, які дозріли в культурі in vitro (табл.7), нами були виявлені такі аномалії, як: диплоїдна метофаза ІІ, анеуплоїдія, клампінг та фрагментація хромосом. В яйцеклітинах корів, що культивували поза організмом, було знайдено 27,5% , а в яйцеклітинах свиней 30% аномалій хромосомного апарату.
Таблиця 7
Результати цитогенетичного аналізу яйцеклітин, що дозріли
поза організмом*
* - У вигляді дробу показано відношення кількості ооцитів з зазначеною аномалією до загальної кількості проаналізованих ооцитів.
Таким чином, нами було встановлено, що кількість ооцитів з ослизненим кумулюсом, отриманих із яєчників корів, була вірогідно вища, ніж кількість таких же ооцитів, отриманих із яєчників свиней. Виявлено, що доля усіх аномалій в яйцеклітинах корів та свиней, культивованих поза організмом, знаходиться на однаково високому рівні і складає 27,5% та 30%, відповідно.
Запліднення яйцеклітин сільськогосподарських тварин поза організмом
Пізнання механізмів запліднення та розробка ефективних методів управління цим процесом є важливим для регулювання розмноження ссавців. Процес запліднення може супроводжуватись деякими порушеннями, наприклад, поліспермією або партеногенезом, а частота порушень складає 31% та залежить від типу овуляції, місця запліднення, виду тварин та віку донора (Понд У.Дж., Хаупт К.А., 1983; Дыбан А.П., 1988; Эрнст Л.К., Сергеев Н.И., 1989; Левин К.Л., 1990). У наших дослідженнях по заплідненню яйцеклітин корів та свиней поза організмом також було виявлено поліспермне запліднення (табл.8).
Таблиця 8
Поліспермне запліднення яйцеклітин корів та свиней поза організмом
* - Р < 0,01
При цьому рівень поліспермного запліднення у великої рогатої худоби був вірогідно нижче (Р< 0,01) у порівнянні з свинею.
Спонтанний партеногенез у наших дослідах не був виявлений (табл.9). Хоча не можна заперечувати, що отримані ембріони можуть розвиватися за типами гіногенезу або ж андрогенезу.
Таблиця 9
Результати запліднення поза організмом та спонтанного
партеногенезу у яйцеклітинах сільськогосподарських тварин
а- Р < 0,001 ; в - Р < 0,001
| 
