|
НАЦIОНАЛЬНА АКАДЕМIЯЯ НАУК УКРАЇНИ
IНСТИТУТ БIОХIМII iм. О. В . ПАЛЛАДIНА
ДІУФ МАМАДУ
УДК. 577.12+577.115+547.915.5+661.715
ПОВЕРХНЕВІ ЛІПІДИ ЗЕРНА СОРГО І КУКУРУДЗИ
03.00.04 - біохімія
Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Киiв- 2002
Дисертація є рукописом
Робота виконана на кафедрі біофізики та біохімії Дніпропетровського національного університету
Науковий керівник: доктор біологічних наук
ШТЕМЕНКО Наталія Іванівна
Дніпропетровський національний університет, зав.каф.біофізики та біохімії.
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
СТАРОДУБ Микола Федорович,
Завідувач відділу біохімії сенсорних і регуляторних систем Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН Украіни;
Кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник ОКАНЕНКО Олександр Аркадійович, старший науковий співробітник кафедри фізіології рослин Київського національного університету ім. Тараса Шевченко
Провідна установа: Чернівецький національний університет ім. Юрія Федьковича, кафедра біохімії, МОН, м. Чернівці
Захист відбудеться “ 21” жовтня 2002 року о 14 годині на засiданнi спецiалiзованої вченої ради Д 26.240.01 в Iнститутi бiохiмiї iм. О. В. Палладiна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Леонтовича,9.
З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Iнституту бiохiмiї iм .О. В. Палладiна НАН Украiни за адресою: Київ, вул. Леонтовича,9
Автореферат розісланий “20” вересня 2002 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат бiологiчних наук КIРСЕНКО. O. B.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Поверхневі ліпіди (ПЛ) рослин – гетерогенна суміш складних естерів (восків), алканів, алканолів, оксосполук і мінорних компонентів, яким властива гідрофобність внаслідок значної величини (С13 – С36) нерозгалуженого вуглеводневого радикала [Bianchi 1987-1989, Prasad 1990, Reinhart 1991, 1993]. Вважають, що основною функцією ПЛ є захист фотосинтетичного апарату від УФ-опромінення і проникнення гідрофільних токсикантів. У роботах наукової групи Дніпропетровського національного університету [Штеменко, Берзеніна 1996-2001] розроблені нові підходи до вивчення ПЛ, виявлені біохімічні особливості формування ПЛ хвойних. Дані про склад і функції ПЛ насіння в літературі обмежені [Bianchi 1979,1984] і наведені тільки для деяких сортів кукурудзи і одного сорту сорго. У той же час відомо, що епікутикулярний шар гідрофобних молекул може виконувати не тільки захисну функцію від опромінення і токсикантів, але також бути бар’єром для патогенів і комах [Jenks 1995]. Особлива увага в роботі приділена сорго – одній із основних сільськогосподарських культур батьківщини автора – Сенегалу. Застосування сучасних хроматографічних, спектральних та інших методів для вивчення ПЛ насіння сорго і кукурудзи актуальне не тільки з погляду встановлення складу ПЛ та їх функцій, що являє собою одне із фундаментальних завдань біохімії, але також є база для виявлення можливих взаємозв’язків мiж складом ПЛ i стійкостю насіння, що є однією з найважливіших фізіолого-біохімічних проблем і може бути використане у селекційно-генетичній роботі.
Зв’язок роботи з науковими темами. Робота виконувалась у рамках бюджетних тем лабораторії біохімії НДІ біології і кафедри біофізики і біохімії ДНУ “Разработка биотехнологии получения веществ из растительного сырья для практического использования” (0196U00259), “Исследование процессов формирования липидного и белкового комплексов растений” (0199U00129), які входять до координаційного плану № 15 Міністерства освіти і науки, “Розробка біотехнології отримання речовин ліпідної природи із рослинної сировини для практичного використання” (0196U000259).
Мета і завдання дослідження. Метою роботи було встановлення класового й внутрішньокласового складу поверхневих ліпідів зерна сорго і кукурудзи, яке має відмінності в біохімічних характеристиках, а також визначення можливих шляхів біосинтезу ліпідних молекул в епідермальних тканинах насіння двох видів злаків.
Для досягнення мети були поставлені такі завдання:
- вивчити спектральні, молекулярно-динамічні характеристики та компонентний склад ПЛ насіння сорго (7 видів) і кукурудзи (4 види);
- дослідити склад вуглеводнів і жирних кислот поверхневих ліпідів зерна сорго і кукурудзи;
- виділити оксосполуки із поверхневих ліпідів зерна сорго у вигляді 2,4 - динітрофенілгідразонів і визначити їх склад.
Об’єкт дослідження – біохімічний склад поверхневих тканин насіння злаків.
Предмет дослідження – стигле зерно сорго (Sorghum) і кукурудзи (Zea mays L.).
Методи дослідження –хроматографія, спектроскопія, функціональним, мас-спектрометрія.
Наукова новизна отриманих результатів. Вперше описано склад основних класів ПЛ зерна сорго й кукурудзи і виявлено відмінності інтенсивності біосинтезу ліпідних молекул в епідермальних тканинах насіння двох видів злаків. Отримані нові дані, які демонструють, що основними класами ПЛ сорго є оксигеновані сполуки, а у ПЛ кукурудзи – складні естери. Доведено зв’язок між складом ПЛ та спектральними й молекулярно-динамічними характеристиками ПЛ. Показано, що склад вуглеводнів і жирних кислот ПЛ зерна сорго й кукурудзи має міжвидові і внутрішньовидові особливості за насиченістю, молекулярною масою, співвідношенням компонентів з парною і непарною кількістю атомів вуглецю. На основі отриманих результатів висунуто припущення про можливі напрямки біосинтезу компонентів ПЛ у поверхневих тканинах насіння рослин.
Практичне значення отриманих результатів. Результати проведених досліджень дозволяють більш глибоко зрозуміти зв’язки між хімічним складом ПЛ зерна рослин різних видів і формуванням гідрофобного біохімічного бар’єра, здатного виконувати захисні функції. Виконані дослідження і висновки значно розширюють уявлення про механізми функціонування різних біосинтетичних процесів в епідермальних тканинах рослин і можуть бути основою спрямованої селекції рослин на цінні сільськогосподарські ознаки.
Особистий внесок здобувача. Особистий внесок здобувача у виконанні представленої роботи полягає у підготовці й проведенні експериментальних досліджень, інтерпретації отриманих результатів. Усі використані в дисертації експериментальні матеріали отримані при безпосередній участі автора. Мас-спектрометричні дослідження виділених автором зразків проведені в Міжнародному центрі наукових досліджень Лейпціг – Хаале ГМБХ (Німеччина).
Апробація результатів дисертації. Матеріали, викладені в дисертаційній роботі, були представлені на міжнародних конференціях: І Міжнародна конференція “Наука і Освіта’98’’. 23-30 квітня 1998 р. Україна “SECO TOX’98’’ International Conference on Ecotoxicology and Environmental Safety. Antalya, Turkey V-e Conference Internationale France et Ukraine, Experience Scientifique et Praсtique dans le contexte du Dialogue des Cultures Nationales. Dnepropetrovsk, Ukraine, 1998 Міжнародна конференція ’’Питання біоіндикації і екології’’, 21-24 вересня 1998, Запоріжжя, III Регіональна конференція молодих учених та студентів з актуальних питань хімії, 21-25 травня 2001, Дніпропетровськ.
Публікацїі. За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт, із яких 3 статті, надруковані в провідних спеціалізованих виданнях.
Структура і об’єм роботи. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів роботи і їх обговорення, узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаної літератури (154 роботи, у тому числі 107 іноземними мовами). Дисертація викладена на 123 сторінках, містить 14 рисунків і 24 таблиці.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обгрунтована актуальність теми і сформульована мета дослідження.
У першому розділі розглянуті відомі на сьогодні дані про склад поверхневих ліпідів насіння рослин, наведені основні біохімічні характеристики зерна сорго і кукурудзи.
У другому розділі описані матеріали і методи дослідження.
У третьому розділі наводяться результати дослідження і їх обговорення.
У четвертому розділі узагальнюються отримані результати і обгрунтовуються висновки.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
Матеріалами дослідження було стигле зерно сорго (Sorghum) сортів Зетра-83, Судзерн-62, Цукрове ДНВ-45, Стрілець-68, Соріз, Степовий-5 і Карликове-45, вирощених у Дніпропетровському інституті зернового господарства УААН, а також стигле зерно кукурудзи (Zea mais L.) гібрида Піонер 3983, лінії кукурудзи ДЛ 300, ДЛ 308, ДЛ 309, які мають відмінності у стійкості до Fusarium moniliforme [Флоря 1983].
Екстракцію ПЛ проводили за схемою [Гусакова 1986]. Тонкошарову хроматографію здійснювали на платівках “Silufol” (Чехія) за [Прохорова 1965]. Інфрачервоні спектри вивчали на спектрометрі Speсord UR-20 у вигляді суспензії речовини у вазеліновому маслі на оптичному склі із броміду кальцію.
Гідроліз сумарних ПЛ, реекстракція і отримання жирних кислот проводили за Кейтс 1975].
Газо-рідинну хроматографію жирних кислот проводили за [Руденко 1971] і [Шаршунова 1980]. Розподіл жирних кислот здійснювали у вигляді метилових естерів.
Диференційний термічний аналіз (ДТА) зразків проводили на дериватографі системи [Паулік-Паулік-Ердей 1987] марки Q-1500 D (МОМ) у динамічному режимі в умовах звичайного теплообміну в інтервалі температур10-500 0С, із швидкістю нагрівання 100 0/хв, еталон - Al2O3,, при масі зразків 0,1 г і реєстрацією кривих ДТА з максимальною чутливістю.
Оксосполуки отримували за реакцією з 2,4-динітрофенілгідразином після розчинення сумарних ПЛ в етанолі [Органікум 1979]. Оксосполуки аналізували шляхом кількісного осаду 2,4-динітрофенілгідразонів. Зважували сухі гідразони і перераховували на вміст оксосполук.
Мас-спектрометричний аналіз 2,4-динітрофенілгідразонів проведено у Міжнародному Центрі наукових досліджень Лейпциг-Хаале ГМБХ (Лейпциг, Німеччина) на мас-спектрометрі Х’юлетт-Паккард НР-5.
Статистичну обробку даних здійснено за [Лакин 1980].
РЕЗУЛЬТАТИ РОБОТИ І ІХ ОБГОВОРЕННЯ
1. Біохімічні характеристики зерна сорго і кукурудзи, що досліджувались. Для дослідження були відібрані насіння рослин із широким спектром фізіолого-біохімічних характеристик перикарпу. Насіння кукурудзи були відібрані згідно зі стійкістю до Fusarium moniliforme, яку виміряли при штучному зараженні початку: гібрид Піонер 3983 (90%), лінії ДЛ 300 (80%), ДЛ 308 і ДЛ 309 (20%). Показано, що кiлькість вільних амінокислот, вилучених із нерозмеленого зерна кукурудзи згідно розробленим ранiше тестом [Вінниченко 1991] зворотньо корелює зі стійкістю (табл.1).
Таблиця 1
Величини оптичних щільностей (D) екстрактів вільних амінокислот із зерна сорго і кукурудзи, (на 1 г сухої маси)
Р≤0,05
Оскільки цей показник для сорго не був визначальним, підбір сортів проводився за кількістю танінів у зерні (табл.2).
Таблиця 2
Вміст танінів у зерні сорго (%)
Р≤ 0,05
Відомо, що вміст танінів корелює зі стійкістю насіння сорго до зовнішніх факторів, зокрема до патогенів [Перуанський 1989]. Два сорти - Карликове-45 і Цукрове ДНВ-42 більш ніж удвічі перевищують інші зразки за цим параметром, тобто можуть вважатися найстійкішими.
2. Спектральні і ТШХ - характеристики поверхневих ліпідів зерна сорго і кукурудзи. Методом ТШХ отримано дані про вміст ПЛ у зерні досліджуваних рослин (табл. 3).
Таблиця 3
Вміст класів поверхневих ліпідів зерна сорго і кукурудзи, у % до загальної кількості
Р≤ 0,05
Наведені дані показали, що зерно кукурудзи вкрите переважно естерами (до 80%), власне восками, які в зерні сорго містяться у незначній кількості (до 6%). Натомість для сорго характерна перевага оксосполук.
Такі значні відмінності у складі сполук, які містять карбонільну групу, виявляються в області поглинання карбонільної групи в ІЧ – спектрах (табл. 4).
Таблиця 4
Співвідношення інтенсивностей смуг поглинання ПЛ зерна сорго і кукурудзи за даними ІЧ спектроскопії
ІЧ-спектри карбонільних сполук в ПЛ сорго представлені більшою кількістю смуг поглинання, ніж в ПЛ кукурудзи, що підтверджує більшу класову гетерогенність перших. Отже, кількість смуг в області поглинання карбонілу може бути показником ступеня оксигенації компонентів ПЛ. Поглинання в цій області ІЧ-спектрів можна віднести на рахунок карбонілів альдегідів, кетонів і карбоксильної групи карбонових кислот [Беллами 1963]. Очевидно, що ІЧ – спектри ПЛ зразків мають значні відмінності, що вказує на різний якісний склад оксосполук і жирних кислот або на різне співвідношення цих речовин в ПЛ зерна сорго сортів, що вивчалися.
3. Вуглеводні поверхневих ліпідів зерна кукурудзи і сорго. Спектр вуглеводнів зерна кукурудзи представлений компонентами від С25 до С33. Якщо умовно розподілити його на дві частини – низькомолекулярну і високомолекулярну (починаючи з С25), то стає очевидним, що в ПЛ стійких форм синтезується майже на 50% більше ніж високомолекулярних компонентів:
С30- і С31-алкани повністю відсутні в нестійких формах, а вміст С29- і С31 алканів у них значно знижений.
Цей факт демонструється композитними хроматограмами стійкої (Піонер 3978) і нестійкої (ДЛ 309) форм (рис. 1).
Порівняння якісного складу вуглеводнів ПЛ зерна кукурудзи у зразках, які мають відмінності щодо стійкості до інфекційних захворювань, показує, що в ПЛ нестійких зразків відбувається різкий зсув у бік низькомолекулярних компонентів. Раніше подібне явище було виявлено при вивченні впливу мутантного гена опейк-2 на фізіолого-біохімічні характеристики зерна кукурудзи: мутація, яка призводить до підвищення поживної якості кукурудзи, одночасно знижувала адаптивний потенціал рослин, що супроводжувалося зниженням молекулярної маси компонентів ПЛ [Штеменко 1994]. Тобто “високолізиновий синдром” – підвищена чутливість рослин до захворювань – супроводжувалася зниженням ефективності процесів елонгації вуглеводневого ланцюга ліпідних компонентів.
ГЖХ-спектри вуглеводнів ПЛ зерна сорго і кукурудзи демонструють значні відмінності за вмістом компонентів з парною кількістю атомів вуглецю: в ПЛ сорго їх значно більше (табл. 5).
Таблиця 5
Склад вуглеводнів поверхневих ліпідів зерна сорго, у % до суми
У деяких зразках сорго неполярних компонентів з парною кількістю атомів вуглецю виявилося більше ніж з непарною, що є досить незвичайним фактом, який на даний час в літературі ще не описаний.
За співвідношенням компонентів з парною і непарною кількістю атомів вуглецю дослідні зразки можна розподілити на дві групи: 1) група, де основними є парні компоненти (Стрілець 68, Судзерн 62); 2) група, де більше непарних компонентів (Соріз, Зетра 83, Степовий 5, Карликове 45). Цукрове ДНВ–42 характеризується приблизно рівномірним співвідношенням компонентів з парною
і непарною кількістю атомів вуглецю.
Отримані дані свідчать про значний вплив генотипу рослин на співвідношення складу вуглеводнів ПЛ сорго.
4. Жирні кислоти поверхневих ліпідів зерна сорго і кукурудзи. Наведені результати отримані методом, який дає інформацію про сумарний склад (зв’язані + вільні) жирних кислот [Берзеніна 2000].
Жирні кислоти ПЛ зерна сорго представлені спектром сполук з вуглеводневим радикалом від С14 до С22 (табл.6).
Таблиця 6
Склад жирних кислот ПЛ зерна сорго, % до суми
Характерною рисою ПЛ сортів, наведених у табл. 6, є наявність значної кількості парних жирних кислот, особливо бегенової (С22) і лігноцеринової (С24). У ПЛ інших сортів зерна сорго бегенова кислота знаходиться в значно менших кількостях, а непарні жирні кислоти переважають.
Існує думка, що бегенова кислота бере участь у процесах естерифікації і входить виключно до складу естерів [Bianchi 1984]. Проте наші дані відносно присутності її великої кількості в зразках, де фракції жирних кислот становлять значну частку ПЛ, дозволяють стверджувати, що вона може знаходитися в ПЛ у вільному стані.
На відміну від ПЛ сорго, у ПЛ зерна кукурудзи знайдені ненасичені жирні кислоти (табл. 7), представлені олеїновою і лінолевою кислотами.
Таблиця 7
Вміст олеїнової, лінолевої, насичених і ненасичених жирних кислот в ПЛ зерна кукурудзи, % до суми
У стійких формах кількість цих жирних кислот значно більша, тобто рівень десатурації (ненасиченості) ПЛ стійких форм вищий, ніж у нестійких. Оскільки біосинтез жирних кислот включає відомі біохімічні шляхи, отримані нами дані демонструють видоспецифічність процесів елонгації, β-окиснення і десатурації в епідермальних тканинах зерна вивчених видів рослин.
5. Оксосполуки поверхневих ліпідів зерна сорго. У табл. 8 подано дані вмісту оксосполук у поверхневих ліпідах сорго, отримані методом функціонального аналізу, а саме – шляхом переведення оксосполуки у 2,4-динітрофенілидразони.
Таблиця 8
Вміст оксосполук у зерні сорго різних видів,
мг/1000 зерен
Зразки №1 – Стрілець 68 і №6 – Цукрове ДНВ 42, містять майже вдвічі більше оксосполук, ніж інші. Оксосполуки – це одна з найменш вивчених фракцій ПЛ рослин. У літературі зустрічаються дані про кількісний вміст цих сполук у ПЛ рослин, але відомості про їх склад
(наприклад, про положення оксогрупи) є предметом дискусій.
Результати ТШХ 2,4–динітрофенілгідразонів ПЛ зерна сорго свідчать, що останні розподіляються переважно на два компоненти – І і ІІ. Обидва компоненти було виділено препаративно і визначено їх структури мас-спектрометричним методом. Встановлено, що їм відповідають С28- і С30-альдегіди.
6. Дослідження поверхневих ліпідів методом ДТА. Дані, які було отримано в результаті дослідження класового і внутрішньокласового складу ПЛ насіння, дозволяють зробити висновок, що ПЛ насіння двох філогенетично близьких видів рослин мають відмінності за молекулярною масою і полярністю. Тому доцільним було застосовувати метод ДТА, який дозволяє оцінити молекулярно-динамічні властивості сумарних ПЛ при зміні температури. Для дослідження обрали ПЛ зразкiв, які мають найбільш контрастні відмінності у класовому складі (табл. 9).
Таблиця 9
Результати термогравіметричних досліджень поверхневих ліпідів зерна кукурудзи і сорго
| 
