|
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
Гончар Юлія Олександрівна
УДК 631.461.5:576.851:155
ОСОБЛИВОСТІ ФУНКЦІОНУВАННЯ АСОЦІАТИВНОЇ СИСТЕМИ: ШОВКОВИЦЯ – АЗОТФІКСУЮЧІ БАКТЕРІЇ РОДУ AZOSPIRILLUM
03.00.07 – мікробіологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ – 2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана у лабораторії біологічного азоту Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН
Науковий керівник: доктор біологічних наук, старший науковий
співробітник Надкернична Олена Володимирівна,
Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН,
завідувач лабораторії біологічного азоту
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Курдиш Іван Кирилович, Інститут мікробіології і вірусології ім.. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу мікробіологічних процесів на твердих поверхнях
доктор біологічних наук, професор Паршикова
Тетяна Вікторівна, Київський національний
університет імені Тараса Шевченка, завідувач
кафедри фізіології та екології рослин
Провідна установа: Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,
м. Київ
Захист відбудеться “19” жовтня 2005 р. о 1200 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143, вул. Заболотного, 154
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: м. Київ, 03143, вул. Заболотного, 154
Автореферат розісланий “10”вересня 2005 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук, с.н.с. Пуріш Л.М.ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Фіксація молекулярного азоту є важливим біологічним процесом, який поряд з фотосинтезом забезпечує існування життя на нашій планеті. Незаперечну роль в цьому процесі відіграють азотфіксуючі мікроорганізми, взаємовідносини яких з рослинами настільки різноманітні, що продовжують залишатися пріоритетним напрямком досліджень сучасної мікробіології, генетики, біохімії і фізіології рослин [Manguiat I., 1985, Anderson A., 1986, Gough C., 1997].
Найбільш ефективним механізмом забезпечення рослин зв’язаним азотом є симбіотична азотфіксація бобовими культурами, що дозволяє без втрат залучати фіксований азот до складу рослини-живителя.
Останні 20 років дослідники багатьох країн світу приділяють велику увагу вивченню асоціативної азотфіксації в кореневій зоні небобових рослин та мікроорганізмам, які здійснюють даний процес. Початок цьому напрямку поклали праці Dobereiner (1972, 1976, 1978). На основі азотфіксуючих мікроорганізмів розроблено біопрепарати, що широко застосовуються у сільськогосподарському виробництві для інокуляції рослин з метою підвищення їх продуктивності та якості врожаю [Skipper H.D., 1980, Антипчук А.Ф., 1997, Іутинська Г.О., 2000, Курдиш І.К., 2001].
На сьогодні не існує єдиної думки відносно просторової локалізації діазотрофів в кореневій зоні рослин [Dobereiner J., 1978, Емцев В. и Чумаков М., 1998]. Найбільш перспективним, на наш погляд, є застосування для інокуляції рослин діазотрофів, що здатні до ендофітії. Така асоціація забезпечує більш тісну, а тому, і більш ефективну взаємодію бактерій з рослиною та більшу стійкість щодо несприятливих умов навколишнього середовища. Відомо, що бактерії родів Azospirillum [Bashan Y., 1986, Bashan B.Y., 1986, Magalhaes F.M., 1979], Bacillus [Klukcas R.V., 1981], Clostridium [Чумаков М.И., 1987], Azotobacter [Sharma S., 1985], Pseudomonas [Lynch J.M., 1983] здатні проникати в зону гістосфери, розмножуватись там і фіксувати атмосферний азот.
Показано, що деякі небобові рослини утворюють на коренях бульбочки під впливом різних факторів і в більшості випадків їх поява зв’язана з проникненням в кореневу систему мікроорганізмів-азотфіксаторів [Родынюк И.С., 1982, Шапошников Г.Л., 1995, Boivin-Masson, 2001, Mattsson U. і Sellstedt A., 2002]. Значний інтерес викликає здатність до формування штучного азотфіксуючого симбіозу різноманітними сільськогосподарськими культурами під впливом біогенних і абіогенних факторів нодуляції [Krol M.J., 1997, Надкерничная Е.В., 1989, Ковальская Н.Ю., 2002]. Розповсюдження можливостей симбіотичної азотфіксації на небобові рослини – важливий спосіб підвищення ефективності біологічної фіксації азота.
Більшість робіт, присвячених асоціативній азотфіксації, проведено зі злаковими та овочевими культурами, в той час як взаємодія діазотрофів з багаторічними дерев’янистими рослинами не вивчалася.
Таким чином, вивчення асоціативної взаємодії мікроорганізмів з багаторічними плодовими рослинами та здатності діазотрофів викликати утворення на коренях даних культур азотфіксуючих бульбочок є незаперечно необхідним і актуальним, оскільки розширює наші уявлення про механізми функціонування мікробно-рослинних асоціацій та може бути основою підвищення родючості ґрунтів, продуктивності сільськогосподарських культур, покращення якості продукції і збереження навколишнього середовища від забруднень.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з НТП УААН: “Наукові основи стійких агроекосистем”, підпрограмою: “Сільськогосподарська мікробіологія”, завданням: “Вивчити взаємодію мікро- та макросимбіонтів при ефективному функціонуванні системи: азотфіксуючі мікроорганізми – рослина” (№ 0101U003749).
Мета і задачі досліджень. Мета роботи – вивчити взаємодію представників роду Azospirillum з рослинами шовковиці у процесі формування ефективних асоціацій; з’ясувати можливість утворення на коренях шовковиці парабульбочок з високою нітрогеназною активністю, а також вивчити вплив інтродукованих мікроорганізмів на продуктивність та якість листя шовковиці.
Відповідно до поставленої мети було сформовано такі завдання:
● вивчити якісний і чисельний склад та нітрогеназну активність азотфіксуючих бактерій кореневої зони шовковиці;
● провести скринінг мікроорганізмів, здатних утворювати ефективні асоціації з рослинами даної культури;
● встановити здатність азоспірил заселяти внутрішні тканини коренів;
● вивчити явище паранодуляції на коренях шовковиці під впливом біогенних та абіогенних факторів нодуляції;
● дослідити вплив азоспірил на продуктивність та якість листя шовковиці;
● розробити на основі ефективного штаму азоспірил препарат для підвищення врожаю та покращення якості листової продукції рослин шовковиці.
Об’єктом досліджень був мікробний ценоз кореневої зони шовковиці, бактерії, виділені з бульбочок “гігантської” шовковиці (Agrobacterium radiobacter 51, A. radiobacter C7, Alcaligenes paradoxus 5, Azospirillum brasilense 53, A. brasilense 54 и A. brasilense 61), шовковиця (Morus alba L.) сортів Українська-5, Українська-6, Українська-7 та гібридні рослини даної культури.
Предметом дослідження була взаємодія азоспірил і рослин шовковиці в процесі формування та функціонування ефективних асоціацій.
Методи досліджень: мікробіологічні – для виділення діазотрофів з мікробних ценозів; фізіолого-біохімічні та культурально-морфологічні – для ідентифікації діазотрофів; генетичного маркування мікроорганізмів, імунологічні та імунохімічні – для ідентифікації ізолятів із внутрішніх тканин шовковиці; газохроматографічний – для визначення азотфіксуючої активності мікроорганізмів і парабульбочок шовковиці; біохімічні – для визначення вмісту в листі мікро- та мікроелементів, органічних речовин, пігментів, вітамінів; вегетаційних та польових дослідів – для визначення ефективності застосування діазотрофів; математично-статистичні – для оцінки вірогідності отриманих результатів.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше вивчено якісний склад і нітрогеназну активність азотфіксуючих бактерій кореневої зони шовковиці.
Вперше розроблена модифікована схема імунізації кролів для отримання штамоспецифічної антисироватки до бактерій A. brasilense 54 з метою ідентифікації ізолятів, виділених із внутрішніх тканин коренів шовковиці. За допомогою генетичного маркування мікроорганізмів, імунологічних та імунохімічних методів доведена здатність азоспірил проникати у внутрішні тканини коренів шовковиці і утворювати стійку асоціацію з рослинами, що ефективно функціонує протягом 16 місяців після інокуляції.
Вперше отримані парабульбочки на коренях стерильних проростків шовковиці та на коренях сіянців, вирощених на нестерильному ґрунті в умовах вегетаційного досліду. Встановлено позитивний вплив 2,4-Д на розвиток кореневої системи шовковиці за одночасної інокуляції азоспірилами проростків та сіянців даної культури.
Вперше показано, що азоспірили здатні підвищувати врожай шовковиці і вміст в листі макро- та мікроелементів, органічних речовин, пігментів і вітамінів.
Розроблено новий біопрепарат ризобразін, діючою основою якого є бактерії A. brasilense 54, а також засоби його застосування на рослинах шовковиці різного віку.
Практичне значення одержаних результатів. Отримано штамоспецифічну антисироватку до бактерій роду Azospirillum, яка дозволяє проводити надійну та швидку ідентифікацію ізолятів, виділених з внутрішніх тканин коренів сільськогосподарських культур.
Для підвищення біометричних показників, продуктивності та якості листя шовковиці рекомендовано біопрепарат різобразін. Розроблені, експериментально перевірені і захищені патентом України способи обробітку рослин шовковиці даним препаратом.
Розроблено спосіб обробітку рослин шовковиці 2,4-діхлорофеноксіацетатом за одночасною їх інокуляцією азоспірилами. Застосування даного прийому сприяє більш інтенсивному розвитку кореневої системи рослин та утворенню парабульбочок на коренях шовковиці.
Особистий внесок здобувача. Виділення мікроорганізмів з кореневої зони шовковиці, вивчення їх властивостей, розробка способів штучного індукування утворення парабульбочок на коренях шовковиці, визначення їх структури проведено дисертантом особисто. Здобувач самостійно проводила лабораторні, вегетаційні та польові дослідження. Облік показників продуктивності рослин в умовах польових дослідів на базі Інституту шовківництва УААН проводили за консультативної підтримки кандидата с.-г. наук Н.О. Олексійченко.
Штами бактерій, використані в роботі, були отримані з колекції корисних ґрунтових мікроорганізмів Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН.
Проведення імунологічних та імунохімічних досліджень проводили сумісно з науковим співробітником відділу фітовірусології та біотехнології Інституту сільськогосподарської мікробіології УААН І.В. Волковою.
Аналіз і теоретичне обґрунтування отриманих результатів, їх узагальнення, інтерпретацію та формулювання основних положень і висновків дисертації, підготовку до друку наукових статей здобувачем проведено особисто під керівництвом наукового керівника дисертаційної роботи д.б.н. О.В. Надкерничної.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень доповідались на конференції молодих вчених “Досягнення і перспективи розвитку агробіотехнології на Україні” (Київ, 2001), ХI міжнародному симпозіумі “Нетрадиційне рослинництво. Эніологія. Екологія і здоров’я” (Алушта, 2002), міжнародній науковій конференції “Стійкий розвиток агроекосистем” (Вінниця 2002), конференції молодих дослідників “Сільськогосподарська мікробіологія: досягнення і проблеми” (Чернігів, 2002), конкурсі робіт молодих вчених (Київ, 2002), конференції молодих вчених “Біологічні науки і проблеми рослинництва” (Умань, 2003), II конференції молодих вчених “Сільськогосподарська мікробіологія: здобутки і проблеми” (Чернігів, 2003), X з’їзді Товариства мікробіологів України (Одеса, 2004), Міжнародній науково-практичній конференції присвяченій 100-річчю з дня народження В.Ю. Казакова (Одеса, 2004), конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників ІМВ НАНУ (Київ, 2005), IX конференції молодих дослідників, присвяченій 100-річчю з дня народження академіка АН УРСР і ВАСГНІЛ П.А. Власюка (Київ, 2005), конкурсі експериментальних робіт молодих дослідників – учасників ІІІ конференції “Сільськогосподарська мікробіологія: здобутки і проблеми” (Чернігів, 2005).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 наукових праць (5 статей, з них 3 – у фахових журналах; один патент, методичні рекомендації, 4 – тези доповідей).
Структура та обсяг роботи. Загальний обсяг дисертації становить 146 сторінок машинописного тексту. Робота складається зі вступу, огляду літератури, 4 розділів експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та списку використаної літератури, який містить 298 першоджерел (з них 149 – англійською мовою). Робота ілюстрована 27 рисунками і 32 таблицями.
Розділ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
В огляді літератури розглянуто асоціативні взаємовідносини діазотрофів з небобовими рослинами, механізми позитивного впливу бактерій на сільськогосподарські культури, а також сучасні погляди на роль ендофітних мікроорганізмів. Показано можливість створення штучного симбіозу (утворення парабульбочок) під впливом абіогенних і біогенних факторів нодуляції.
ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА
Розділ 2. Матеріали і методи досліджень
Об’єктами досліджень були: діазотрофи, виділені з кореневої зони шовковиці та з бульбочок, що спонтанно утворилися на коренях “гігантської” шовковиці (Agrobacterium radiobacter 51, A. radiobacter C7, Alcaligenes paradoxus 5, Azospirillum brasilense 53, A. brasilense 54 и A. brasilense 61); рослини шовковиці (Morus alba L.) сортів: Українська-5, Українська-6, Українська-7 і гібридні насадження шовковиці.
Досліджували чисельність діазотрофів в ризосфері, ризоплані та гістосфері рослин шовковиці. Визначення чисельності та виділення азотофіксуючих бактерій проводили за методами, загальноприйнятими у ґрунтовій мікробіології та з використанням методик, що описані в оригінальних роботах авторів: сімбіотрофні асоціації досліджували методом граничних розведень на рідкому глюкозо-автолізатному середовищі Федорова в модифікації Калінінської, олігонітрофілы – на напіврідкому середовищі Ешбі, клостридії - на середовищі Виноградського [Калінінська Т. А., 1981]. Чисельність флюоресцируючих псевдомонад визначали на середовищі з гліцерином (0,1%), лактатом аммонію (0,025%) та глутаматом натрію (0,05%) [Iizuka H., 1963]. Бактерії роду Azospirillum вивчали на середовищі Доберейнер модифікованого складу [Калінінська Т. А., 1981] та на агаризованому середовищі з конго червоним [Caceras S. A. R., 1982], Азотобактер – на діагностичному середовищі [Fenglerowa W., 1965]. Виділення діазотрофів, вивчення їх морфологічних та фізіолого-біохімічних властивостей проводилось загальноприйнятими у ґрунтовій мікробіології методами [Методы культивирования азотфиксирующих бактерий, 1991, Звягинцев Д.Г., 1980].
Нітрогеназну активність бактерій у чистій культурі та азотофіксуючу здатність парабульбочок визначали ацетиленовим методом на газовому хроматогрфі Chrom – 4 з полум’яно-іонізаційнимм детектором на колонці з в – в-діоксіпропіонітрилом [Умаров – 1976 г.]. Температура термостату 50оС. Витрата газів: водню – 30 мл/хв, азоту – 100 мл/хв, повітря – 500 мл/хв.
Культурально-морфологічні та фізіолого-біохімічні властивості діазотрофів вивчали загальноприйнятими у мікробіології методами, а також з використанням методів світлової та електронної мікроскопії [Г. Шиммель, 1972].
В лабораторних дослідах вивчали вплив діазотрофів на схожість, дружність та швидкість проростання насіння шовковиці [Гродзинский А. М., 1973].
Початкові етапи взаємодії штамів азоспірил з рослинами шовковиці вивчали в умовах лабораторних дослідів. Простерилізоване насіння інокулювали бактеріальною суспензією A. brasіlense 54, з титром 200 тис. клітин на одну насінину. Через 5-10 діб після інокуляції коріння проростків довжиною 1 см мікроскопіювали і підраховували кількість морфологічно змінених кореневих волосків [Коннова С.А., 2003].
Визначали здатність бактерій проникати у внутрішні тканини коренів шовковиці, використовуючи метод генетичного маркуваня популяцій [Елементи регуляції в рослинництві: Зб. наук. пр., 1998]. Антибіотикостійкі мутанты отримували за методом Зибальського [Методы общей бактериологии, 1984], використовуючи градієнт концентрації стрептоміцину в агарі.
Дослідження взаємодії діазотрофів з рослинами шовковиці проводили також за допомогою імунологічних методів [Ouchterlony O., 1953, Никитин В.М., 1982]. Тварин імунізували відмитою фізіологічним розчином бактеріальною суспензією з оптичною густиною Д660нм=1,3, що відповідає концентрації 3х1010 кл/мл. Як адьювант використовували мантанід ISA 25. Нами запропонована модифікована схема імунізації, за якою була отримана штамоспецифічна антисироватка з титром 1:32 в реакції преципітації і 4х105 в реакції твердофазного імуноферментного аналіза.
Явище паранодуляції вивчали лабораторними методами. Стерильні життєздатні проростки шовковиці, які вирощували в пробірках з напіврідким середовищем інокулювали азоспіриллами при одночасній обробці їх 2,4-дихлорофеноксіацетатом в концентрації 5х10-6 г діючої речовини на 10 мл середовища. Явище паранодуляції вивчали також в умовах вегетаційного досліду на нестерильному ґрунті. В ємкості з проростками на стадії появи бокових коренів вносили 2,4-Д в концентрації 5х10-4 г діючої речовини на 1 кг ґрунту за одночасної інокуляції азоспіриллами (бактеріальне навантаження – 2-4х105 клітин на 1 рослину шовковиці). Структуру парабульбочок вивчали під світловим мікроскопом.
Через 4 та 16 місяців після інокуляції рослин шовковиці визначали вміст в листі калію [ГОСТ 30504-97.], кальцію [ГОСТ 26570-95], магнію [Лебедев П.Т., Усович А.Т., 1976.], марганцю [ГОСТ 27997-88.], міді [ГОСТ 27995-88.], цинку [ГОСТ 27996-88.], заліза [ГОСТ 27998-88.], сирого жиру [ГОСТ 13496. 15-97], розчинних вуглеводнів [Ермаков А.И., 1987], загального азоту і білку [ГОСТ 13496.4-93], вітамінів [Нестеров Е.А., 1976, Лебедев П.Т., Усович А.Т., 1976.], хлорофілу [Гродзинский А.М., Гродзинский Д.М., 1973] та каротину [ГОСТ 13496.17-95].
В умовах вегетаційних і польових дослідів вивчали вплив інокуляції азоспіриллами на біометричні показники та продуктивність шовковиці. Планування, проведення польових дослідів, нагляд і облік проводили за методиками польового досліда [Доспехов Б.А., 1985] та методикою державного сортодослідження сільськогосподарських культур (1983). Обробку отриманих даних проводили, користуючись методами математичної статистики [Доспехов Б.А., 1985].
Розділ 3. Відбір азотофіксуючих мікроорганізмів, що здатні утворювати ефективні асоціації з рослинами шовковиці
Вивчено якісний склад і нітрогеназну активність азотфіксуючих бактерій кореневої зони шовковиці. З різоплани, ризосфери та гістосфери рослин на різних середовищах було виділено 87 чистих культур азотфіксуючих бактерій. Їх здатність засвоювати молекулярний азот коливалась в межах від 0,5 до 140 нмоль етилену на посудину (табл. 1). Високою здатністю до азотфіксації характеризувалися представники родів Azotobacter, Bacillus, Enterobacter, Azospirillum, Pseudomonas.
Таблиця 1
Нітрогеназна активність чистих культур діазотрофів, виділених з кореневої зони і бульбочкоподібних структур шовковиці, що відрізнялась гігантизмом
Нітрогеназна активність азоспірилл, виділених з ризосферного грунту і різоплани шовковиці була в 6 – 9 раз нижче, ніж у штамів даного роду, виділених з бульбочкоподібних структур шовковиці.
Визначали вплив інокуляції шовковиці активними штамами діазотрофів. Показано, що азоспірили на відміну від інших азотфіксуючих бактерій здатні здійснювати пролонговану дію на продуктивність насаджень шовковиці.
Інтродукція бактерій роду Azospirillum в кореневу зону шовковиці забезпечила через 4 місяці прибавку урожаю листя – 30-48%, а через 16 місяців – 50-53% (табл. 2, 3).
Таблиця 2
Вплив азоспірил на врожай листя гібридних насаджень шовковиці (польові досліди, чорноземний грунт, 2001-2002 рр.)
Примітка: достовірне підвищення показників виділено жирним шрифтом.
Таблиця 3
Пролонгований вплив азоспірил на врожай листя гібридних насаджень шовковиці (польовий дослід, чорноземний грунт, 2001-2002 рр.)
Примітка: достовірне підвищення показників виділено жирним шрифтом.
Таким чином, прибавка урожаю листя через 16 місяців після інтродукції штамів А. brаsilense 53 і А. brаsilense 54 перевищувала аналогічну прибавку, отриману в рік інтродукції даних штамів в кореневу зону рослин шовковиці, що свідчить про можливу здатність діазотрофів А. brаsilense 53 та А. brаsilense 54 проникати у внутрішні тканини кореня і, тим самим, здійснювати пролонговану позитивну дію на рослину протягом декількох вегетаційних періодів, що забезпечує не тільки більш тривале існування ефективної асоціації мікро- та макроорганізма, але й більш тісну їх взаємодію, а тому і більш інтенсивний обмін метаболітами.
Одним з показників виділення мікроорганізмами біологічно активних речовин є збільшення кореневої поверхні рослин. В результаті інокуляції насіння штамами A. brasilensе 53 и A. brasilensе 54 довжина кореневої системи рослин шовковиці підвищувалась в 2, а маса – в 3 рази. Таке значне підвищення параметрів кореневої системи рослин шовковиці пояснюється виділенням азоспіриллами біологічно активних речовин. Як наслідок ми спостерігали достовірне підвищення вмісту в листі шовковиці вітамінів на 8-16% через 16 місяців після інокуляції.
Таким чином, пролонгована позитивна дія азоспірил на урожай листя шовковиці та підвищення вмісту в ньому вітамінів, свідчить на користь можливості досліджуваних бактерій проникати у внутрішні тканини кореня рослин шовковиці, розмножуватись там і зберігати життєздатність протягом двох вегетаційних періодів після інокуляції.
Розділ 4. Вивчення здатності A. brasilense вступати в ендоризосферні асоціації з рослинами шовковиці
Характер взаємодії Azospіrіllum brasіlense з рослинами шовковиці при утворенні ефективних асоціацій вивчали з перших етапів розвитку мікробно-рослинних взаємовідносин.
Вивчення зміни морфології кореневих волосків під впливом інокуляції проростків шовковиці штамами азоспірил показало, що дані бактерії здатні викликати деформації кореневих волосків. Ми спостерігали прямі кореневі волоски в контролі (без інокуляції) (рис. 1) і деформовані: скручені у вигляді спіралі, гачковидно зігнуті та булавовидні кореневі волоски (рис. 2, 3) в результаті інокуляції проростків азоспірилами, що свідчить про здатність бактерій викликати зворотну реакцію рослин шовковиці [Егоренкова И.В., 2000, Федоненко Ю.П., 2001].
Визначали вплив інокуляції азоспірилами насіння шовковиці на кількість деформацій кореневих волосків проростків даної культури. Штами A. brasіlense 53, A. brasіlense 54 и A. brasіlense 61 забезпечили достовірне підвищення кількості морфологічних змін кореневих волосків в порівнянні з контролем в 6,6 – 7,8 разів.
Рис. 1. Недеформовані кореневі волоски контрольних рослин
Рис. 2. Гачковидні та спіралевидні кореневі волоски при інокуляції проростків шовковиці A. brasіlense 54.
Рис. 3. Булавовидні кореневі волоски при інокуляції проростків шовковиці A. brasіlense 54.
З метою визначення здатності азоспірил проникати у внутрішні тканини кореня шовковиці було отримано стрептоміцинстійкий штам A. brasіlense 54, який не відрізнявся від вихідного штаму по культурально-морфологічним і фізіологічним ознакам і належав до S-типу. Не змінилась також нітрогеназна активність мутантної культури та її здатність позитивно впливати на продуктивність сіянців шовковиці.
Через 60 діб після інокуляції з поверхнево стерилізованого коріння були виділені реізоляти стрептоміцинстійких мутантів, що доводить здатність азоспірил проникати у внутрішні тканини рослин шовковиці.
Для підтвердження здатності досліджуваного штаму проникати в тканини коренів рослин шовковиці паралельно з методом генетичного маркування ми використовували імунологічні методи. Застосовуючи модифіковану нами схему імунізації кролів, була отримана штамоспецифічна антисироватка з титром 1:32 в реакції преципітації і 4х105 в реакції твердофазного імуноферментного аналізу, що дозволило використати її для дослідження можливості проникнення штаму Azospіrіllum brasіlense 54 у внутрішні тканини коренів шовковиці. З поверхнево стерилізованих коренів через 16 місяців після інокуляції були виділені ізоляти №1, 2, 3, 4, 5, з коренів рослин шовковиці через 4 місяці після інокуляції – ізоляти №6, 7, 8. Ізоляти №1, 2, 6 утворювали смуги преципітації зі штамоспецифічною антисироваткою.
Твердофазний імуноферментний аналіз (ТІФА) проводили на полістиролових планшетах в непрямому варианті. (табл. 4). Аналіз представлених даних дозволяє зробити висновок, що ізоляти №1, 2, 6 відповідають штаму A. brasіlense 54.
Таблиця 4.
Результати імуноферментного аналізу ізолятів бактерій, виділених з коренів дерев шовковиці.
- - Співвідношення ОГ досліджуваного зразка до ОГ негативного контролю.
Таким чином, результати ТІФА свідчать про те, що азоспірили здатні проникати в корені рослин шовковиці та зберігати життєздатність протягом 16 місяців після інтродукції бактерій в кореневу зону цієї культури.
| 
