|
ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН
СТЕФАНИШИН ОЛЬГА МИХАЙЛІВНА
УДК 557.152.34:636.2:612.32
ОСОБЛИВОСТІ ПРОТЕОЛІТИЧНИХ ПРОЦЕСІВ
У ТРАВНОМУ ТРАКТІ ТЕЛЯТ
03.00.04 – біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Львів – 2003
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.
Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор
Сологуб Леонід Ілліч
Інститут біології тварин УААН,
завідувач лабораторії обміну речовин
Офіційні опоненти - доктор біологічних наук, професор
Янович Вадим Георгійович
Інститут біології тварин УААН,
завідувач лабораторії біології росту і розвитку тварин
- доктор біологічних наук, професор
Малик Остап Григорович
Державний науково-дослідний контрольний інститут
ветеринарних препаратів та кормових добавок МАПУ,
завідувач відділом фармакології та імунології
Провідна установа - Львівський національний університет імені Івана
Франка Міністерства освіти і науки України,
кафедра біохімії, м. Львів
Захист відбудеться " 22 " квітня 2003 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН (79034, м. Львів, вул. Стуса, 38).
З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту біології тварин УААН за адресою: 79034 , м. Львів, вул. Стуса, 38.
Автореферат розісланий " 20 " березня 2003 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради О. І. ВіщурЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Ефективність використання кормів телятами на ранніх етапах постнатального розвитку значною мірою залежить від морфофункціонального розвитку рубця, який впливає на ріст симбіотичних мікроорганізмів і ступінь розщеплення поживних речовин, у тому числі протеїну корму (Van Soest P.J., 1982; Янович В.Г., Сологуб Л.І., 2000). Протеолітична активність мікроорганізмів рубця телят значно підвищується після переходу від молочного живлення до рослиннго (Cotta M.A., Hespell R.B., 1986; Bergner H., 1991; Griswold K.E., White B.A., 1999). У результаті розщеплення протеїну корму протеїназами мікроорганізмів у рубці утворюються пептиди і амінокислоти, частина яких використовується мікроорганізмами у синтезі власних білків, котрі після розщеплення у тонкому кишечнику панкреатичними і кишечними протеїназами служать основним джерелом амінокислот для телят (Tamminga S., 1979; Orskov E.R., 1982). Іншим джерелом амінокислот для телят є важкорозщеплюваний протеїн корму, що не розщеплюється мікроорганізмами в рубці, а гідролізується протеїназами у тонкому кишечнику (Stern M.D., 1994; Vagnoni D.B., Broderick G., 1997). Загалом, ефективність засвоєння протеїну корму телятами залежить від активності протеїназ у рубці і кишечнику, на яку значною мірою впливає склад протеїну, наявність у кормах активаторів і інгібіторів протеолітичних ферментів. Цим пояснюється науково-практична актуальність досліджень, скерованих на з’ясування вікових особливостей протеолізу в рубці і тонкому кишечнику телят, ролі окремих протеїназ у розщепленні протеїну корму, механізмів і чинників регуляції їх активності. Наявні в літературі дані такого плану (Bas F.J., 1989, Khorasani G.R., 1994) фрагментарні і недостатні для широких узагальнень.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є етапом теми:“Вивчення механізмів субстратної регуляції процесів травлення і засвоєння поживних речовин корму у телят і розробити систему їх повноцінного живлення”, шифр 07.03 № держреєстрації 0198U009002. Досліди виконано в лабораторії обміну речовин Інституту землеробства і біології тварин УААН у 1996-2000 роках (здобувач дослідила протеолітичну активність і протеїнази вмісту рубця та хімусу 12-палої кишки телят, субстратну залежність активності протеїназ у перелічених відділах травного тракту, розподіл протеїназ серед білків фракцій рубцевої рідини залежно від молекулярної маси, здійснила часткове очищення нейтральної серинової протеїнази із безклітинної рідини рубця телят).
Мета i завдання дослідження. Метою дисертаційної роботи було з’ясувати вікові особливості протеолітичних процесів у рубці і 12-палій кишці телят. Для реалізації цієї мети поставлено такі завдання:
- дослідити протеолітичну активність у вмісті рубця і хімусі 12-палої кишки телят на різних етапах постнатального розвитку;
- здійснити часткове очищення протеїназ симбіотичних мікроорганізмів вмісту рубця телят - бактерій і інфузорій;
- з’ясувати деякі фізико-хімічні властивості протеїназ симбіотичних мікроорганізмів рубця телят;
- дослідити залежність активності протеїназ мікроорганізмів рубця телят від білків-субстратів, концентрації водневих іонів, інгібіторів, активаторів, катіонів, аніонів та інших модуляторів.
Об’єкт дослідження –протеолітична активність вмісту рубця і хімусу 12-палої кишки телят.
Предмет дослідження –протеїнази рубця та 12-палої кишки телят.
Методи досліджень. Кількісне оцінювання активності протеїназ вмісту рубця та хімусу 12-палої кишки спектрофотометричними методами, визначення вмісту білка колориметричним методом; фракціонування вмісту рубця з використанням градієнтного центрифугування; хроматографічне розділення та очищення протеїназ окремих фракцій рубцевої рідини; підрахунок бактерій та інфузорій в камері Горяєва під мікроскопом.
Наукова новизна одержаних результатiв. Вперше здійснено комплексне дослідження протеолітичної активності протеїназ у вмісті рубця та хімусі 12-палої кишки телят. Визначено: вікові особливості цих процесів; субстратну залежність активності протеїназ у перелічених відділах травного тракту, вплив на її рівень концентрації протонів водню, інгібіторів протеїназ, катіонів, інших модуляторів. Проведено розділення протеїназ рубцевої рідини залежно від молекулярної маси та визначено деякі їхні фізико-хімічні та функціональні особливості. Вивчено властивості частково очищеної нейтральної серинової протеїнази, виділеної із безклітинної рідини рубця телят.
Практичне значення одержаних результатів. Результати виконаних досліджень розширюють знання про особливості травлення в телят у перші місяці їхнього життя і можуть бути використані при розробці норм живлення молодняку великої рогатої худоби (ВРХ) з метою підвищення їх продуктивності. Одержані дані можна використати при читанні лекцій з годівлі тварин студентам ветеринарних вузів.
Особистий внесок здобувача. Автор виконала весь обсяг експериментальних досліджень, статистично опрацював результати, провів пошук наукової літератури за темою дисертації. Планування досліджень, аналіз та інтерпретація отриманих результатів здійснено за участю наукового керівника д-ра біол. наук, проф. Л. І. Сологуба.
Апробація результатів дисертації. Про основні результати дисертаційної роботи доповідалось на звітних сесіях вченої ради Інституту біології тварин (1999-2001); на Міжнародній науковій конференції “С. З. Гжицький і сучасна аграрна наука” (м.Львів, 2000, ЛДАВМ); на ІІІ Міжнародній конференції “Актуальные проблемы биологии в животноводчестве” (м. Боровськ, Росія, 2000); на конференції молодих вчених, присвяченій 85-річчю від дня народження професора З. П. Скородинського (м. Львів, 2000, ІБТ); на Міжнародній конференції “Animal Sciences in the XXI century” (м. Краків, Польща, 2001, Agric.Univ. of Krakow);
Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 статей у фахових наукових виданнях і 2 тези доповідей у матеріалах конференцій.
Структура і обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження та їхнього обговорення, висновків, а також списку літератури (306 найменувань). Робота викладена на 156 сторінках і містить 37 рисунків і 25 таблиць.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Загальна методика та основні методи досліджень. Експериментальну частину роботи виконано на 2-х групах поліфістульних (рубця і 12-палої кишки) бичків-аналогів чорно-рябої породи віком від 30-ти до 180-ти днів (по 6 голів у групі) у 1998 і 1999 роках у весняно-літний період у дослідному господарстві Інституту біології тварин УААН. Тварин годували відповідно до визначених норм. Утримання стійлове.
Для біохімічних досліджень вміст рубця і хімус 12-палої кишки відбирали через 2 години після ранкової годівлі в 1-, 2-, 3-, 4-, 5- і 6-місячному віці тварин. У першій серії дослідів у зразках вмісту рубця та хімусі 12-палої кишки визначали протеолітичну активність за звільненням циклічних амінокислот при інкубації аліквот з казеїном (Wallace R., 1985), концентрацію загального білка за методом Лоурі (Lowry O.H., 1951), целюлозолітичну активність (Паєнок С.М., 1970). Вплив інгібіторів, активаторів та інших модуляторів на активність протеїназ вмісту рубця і хімусу 12-палої кишки телят в окремих варіантах досліджень визначали, додаючи до інкубаційної суміші 0,1 мл розчину модулятора у відповідній концентрації (замість 0,1 мл тріс-НСl буферу):
- катіони: CaCO3 (50 мM), CaCO3 (1000 мM), MgCl2 (100 мM), MnCl2 (100 мM), ZnCl2 (100 мM), CoCl2 (100 мM), CuCl2 (100 мM), BaCl2 (100 мM), FeCl2 (100 мM), CrCl3 (100 мM), CdCl2 (100 мM), NiCl2 (100 мM);
- аніони: Na2SO4 (100 мM);
- акцептори водню: глутатіон окиснений (GSSG) (50 мМ);
- SH-вмісні сполуки: цистеїн (50 мМ), дитіотреітол (ДТТ) (50 мМ), глутатіон відновлений (GSH) (50 мМ);
- макроергічні сполуки : аденозинтрифосфорна кислота (АТФ) (100 мМ);
- іонні детергенти : додецилсульфат натрію (ДДС-Na) (50 мМ);
- інгібітори протеїназ: цистеїнових - п-хлормеркурибензоат (п-ХМБ) (10 мМ), лейпептин (100 мкг/мл); серинових - фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ) (20 мМ); діізопропілфторфосфат (10 мМ), тозилфенілаланінхлорметилкетон (10 мМ), інгібітор трипсину із сої (5мг/мл); аспартатних – пепстатин А (10 мМ); металопротеїназ - етилендіамінтетраацетат (ЕДТА) (100 мМ), 1,10-фенантролін (10 мМ).
Дослідження різних білків, як субстратів дії протеїназ у вмісті рубця та хімусі 12-палої кишки телят в окремих дослідах здійснювали із заміною казеїну на: альбумін сироватки бика (10 мг/мл), гемоглобін (10 мг/мл), горох нативний (30 мг/мл), горох екструдований (30 мг/мл), макуху ріпакову нативну (30 мг/мл), макуху ріпакову екструдовану (30 мг/мл) (кормові інградієнти у перемеленій формі).
У другій серії дослідів зразки вмісту рубця 6-місячних бичків розділяли на окремі фракції: бактерії, інфузорії, кормові частинки, безклітинну рідину (Кафа- ров М.Ш., Алиев А.А., 1971). Розділення протеїназ окремих фракцій вмісту рубця здійснювали за допомогою гельфільтрації на колонці, заповненій сорбентом Toyopearl НВ-55 і зрівноваженій 0,025 М тріс-HCl буфером рН 7,0. Елюцію білків проводили цим же буфером при швидкості току рідини 1 мл за хвилину і відбирали по 5 мл кожної фракції. Протеїнази кормових частинок не розділяли, оскільки екстракція і гельфільтрація цієї фракції вимагала складнішого опрацювання матеріалу. Для подальших досліджень сусідні фракції елюатів з високою протеїназною активністю об’єднували.
Підрахунок кількості бактерій і інфузорій у рубцевій рідині 1-6-місячних бичків проводили у камері Горяєва під мікроскопом (Тараканов Б.В., 1998).
Концентрацію протонів водню визначали за допомогою іонометра ЭВ-74.
Одержані результати досліджень опрацьовували статистично.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Вікові особливості протеолітичних процесів у рубці та хімусі 12-палої кишки телят 1-6 місячного віку. Як бачимо з рис. 1, концентрація білків у рубці та у хімусі 12-палої кишки 1-місячних бичків становить приблизно 12 % від сухої маси вмісту рубця. До 2-місячного віку тварин цей показник у рубці зростає, а далі змінюється мало. У хімусі 12-палої кишки збільшення концентрації білків спостерігається лише до 2-місячного віку телят. Вміст білків симбіотичних мікроорганізмів, а тим самим їхня кількість у рубці з віком телят також зростає. Якщо порівняти концентрацію білків у рубці 1-місячних бичків і тварин старшого віку, то вже у 2-місячних тварин він у 2,2 рази, у 3-місячних – у 2,6, а у 4-місячних і старших понад 3 рази вищий.
Отже, з віком у телят популяція як бактерій, так і інфузорій у вмісті рубця зазнає певних змін, які відображаються на кількості білків їхніх клітин. Як бачимо з табл. 1, у 1-місячних телят кількість клітин бактерій і інфузорій у рубці значно менша, порівняно з їхньою кількістю у старших тварин і становить в середньому відповідно 450 млн і 150 тис клітин на 1 мл рідини. Таке приблизно співвідношення
Рис. 1. Концентрація білків у рубцевій рідині та хімусі 12-палої кишки телят різного віку (M±m, n=6): а – загальний білок (рубець); б – білки мікроорганізмів (сума); в – білки бактерій; г – білки інфузорій; д – білки кормів; е – загальний білок (12-пала кишка).
спостерігається й у 3- і 6-місячному віці, хоча маса популяції клітин бактерій та інфузорій з віком телят значно збільшується. Однак, істотно змінюється видовий склад популяції і кількісне співвідношення видів з різною ферментною, зокрема, з протеолітичною специфічністю.
Таблиця 1
Кількість бактерій і інфузорій у рубці телят різного віку (M±m, клітин на мл, n=6)
Як бачимо з рис. 2, А - протеолітична активність, яка виявляється при нейтральних значеннях рН, у рідині рубця з 1- місячного до 6-місячного віку тварин, поступово зростає майже у 3 рази. Водночас активність протеїназ, які проявляються при вищих концентраціях протонів водню (рН 5,0), у вмісті рубця змінюється з віком тварин меншою мірою (у 6-місячному віці тварин вона лише приблизно в 2 рази вища, ніж в 1-місячному віці).
Рис 2. Активність протеїназ в рідині рубця телят (A) і хімусі 12-палої кишки (Б) у різному віці (М±m, n=6); * - різниця вірогідна між двома суміжними віковими групами (Р<0,05).
Протеолітична активність з оптимумом дії при рН 5,0 в хімусі 12-палої кишки (див.рис. 2, Б) є значно вищою (приблизно в 10 разів вища, ніж у рідині рубця) і до 6-місячного віку її рівень зростає ще у 2,6 рази. Можливо, в цьому випадку посилення протеїназної активності у верхній ділянці тонкої кишки відбувається за рахунок сичужних ферментів.
З метою визначення субстратної специфічності протеїназ вмісту рубця і хімусу 12-палої кишки телят здійснено дослідження інтесивності розщеплення різних білків під їх впливом. Як бачимо із табл. 2, у 6-місячних телят протеїнази вмісту рубця і хімусу 12-палої кишки розщеплюють різні білки з різною швидкістю.
Таблиця 2
Розщеплення білків in vitro протеїназами вмісту рубця і хімусу 12-палої кишки за нейтральних значень рН (n=6)
Примітки: 1) * - різниця в інтенсивності розщеплення казеїну і даного субстрату вірогідна (Р<0,05); 2) ** - різниця у швидкості розщеплення нативного і екструдованого субстрату вірогідна (P <0, 05); 3) *** - різниця у швидкості розщеплення самого казеїну і з добавкою даної сполуки вірогідна (Р<0,05)
Порівняно високою швидкістю розщеплення в рубці відзначаються казеїн і гемоглобін, а альбумін - нижчою. У хімусі 12-палої кишки активність протеїназ порівняно до альбуміну є вищою, ніж до глобуліну. Очевидно, в розщепленні альбуміну у рубці та кишках беруть участь різні протеїнази, про що засвідчує їхня неоднакова чутливість до інгібіторів: альбуміндеградуючі ферменти рубця є значно чутливіші до п-хлормеркурибензоату, ніж ферменти кишок. Що стосується казеїну і гемоглобіну, то в їх розщепленні в обох відділах основну роль відіграють серинові протеїнази. Швидкість розщеплення білків гороху і макухи, порівняно з розщепленням чистих білків – казеїну і гемоглобіну, є невисокою. Відзначено малу інтенсивність розщеплення білків нативного гороху порівняно з деградацією білків екструдованого гороху чи нативної макухи. У даному випадку важливу роль відіграють інгібітори серинових протеїназ, кількість яких у тканинах бобових рослин велика. У деградації білків гороху і макухи (див. табл. 2) основну роль відіграють ферменти серинового типу, оскільки їхня активність чутлива до фенілметилсульфонілфториду і мало змінюється під впливом інгібітора цистеїнових ферментів – п-хлормеркурибензоату.
Результати щодо розщеплення білків нативного гороху в хімусі 12-палої кишки не відповідають дійсному стану , оскільки в умовах in vivo вони попадають з сичуга в кишки у денатурованому вигляді. Насправді у 12-палій кишці його розщеплення відбувається значно швидше, ніж у нашому досліді в умовах in vitro. Білки гороху і макухи після денатурування екструзією деградуються в рубці приблизно з однаковою швидкістю. Розщеплення білків екструдованого гороху і макухи в рубці (див.табл.2) відбувається частково цистеїновими протеїназами, оскільки додавання п-хлормеркурибензоату знижує його інтенсивність приблизно наполовину. Разом з тим, у хімусі 12-палої кишки білки і нативних, і екструдованих досліджуваних концкормів переважно деградуються під дією серинових протеїназ. Відомо, що в регуляції активності ферментів та перетворень окремих сполук важливу роль відіграє рівень продуктів, які утворюються в каталізованих ними шляхах перетворень. Як бачимо з табл. 2, додавання ацетату натрію помітно не впливає на швидкість деградації білків, оскільки основним джерелом його утворення є не дезамінування амінокислоти гліцину, а ферментація вуглеводів полімерів. Цікаво, що метіонін, доданий до інкубаційного середовища, вірогідно гальмує розщеплення казеїну протеїназами як вмісту рубця, так і хімусу 12-палої кишки, тоді як глутамінова кислота помітно не впливає на рівень ферментної активності. Ймовірно, що на активність протеїназ у рубці впливає не лише кількість вивільнених у процесі протеолізу амінокислот, але й якісний їх склад і потреба у кожній із них, зокрема. У кишках регуляторні ефекти амінокислот на протеолітичні процеси проявляються слабше.
Стосовно вікових особливостей розщеплення різних білкових субстратів, то, як бачимо з рис. 3, інтенсивність розщеплення казеїну протеїназами рубця 1-місячних телят більша, ніж його розщеплення у 6-місячних телят (Р<0,01). У цьому випадку вірогідне зниження казеїнолітичної активності спостерігається протягом 4-го місяця життя тварин (P<0,05). В інтенсивності розщеплення альбумінів та глобулінів протеїназами вмісту рубця телят між суміжними віковими групами вірогідних змін не виявлено, хоча певну тенденцію щодо її збільшення виявлено. Це стосується, зокрема, гемоглобінрозщеплюючої активності, різниця в якій між 1- і 6-місячними телятами статистично вірогідна. В інтенсивності розщеплення білка інсуліну протеїназами рубця виявлено певне зростання з 1- до 3-місячного віку телят (P<0,001), а далі спостерігається її зниження до 6-місячного віку (P<0,001). Очевидно, розщеплення цього білка відображає зміни у відновних процесах і відновному потенціалі рідини рубця, необхідного для редукції сульфгідрильних зв’язків між А і В поліпептидними ланцюгами молекули, що є першим етапом в її деградації. Водночас розщеплення білків гороху і макухи протеїназами вмісту рубця 1-місячних телят незначне, а основне зростання інтенсивності цього процесу відбувається лише на третьому місяці життя тварин, тобто під час їхнього переведення на годівлю грубими кормами (P<0,001). Згодом ці зміни стають незначними (P>0,05).
| 
