|
ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ ТВАРИН УААН
СЛИВЧУК ЮРІЙ ІВАНОВИЧ
УДК 636.2:57.089.38:577.15.17
ОКИСНО-ВІДНОВНІ ПРОЦЕСИ В МІТОХОНДРІЯХ ТКАНИН
ТЕЛИЦЬ І КОРІВ ЗА УМОВ ПОЛІОВУЛЯЦІЇ, ВИКЛИКАНОЇ ГОНАДОТРОПІНАМИ
03.00.04 – біохімія
АВТОРЕФЕРАТ
Дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата ветеринарних наук
Львів – 2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті біології тварин УААН.
Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор Смолянінов
Борис Вікторович, Одеський державний аграрнийуніверситет, завідувач кафедри фізіології та біохімії
сільськогосподарських тварин
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Сологуб
Леонід Ілліч, Інститут біології тварин УААН, завідувач лабораторії обміну речовин;
доктор ветеринарних наук, професор Гуфрій
Дмитро Федорович, Львівська національна академія ветеринарної медицини ім. С.З. Гжицького, завідувач кафедри фармакології і токсикології
Провідна установа - Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів і кормових добавок Міністерства аграрної політики України,
відділ фармакології і імунології, м. Львів
Захист дисертації відбудеться „__”___________________о____годині на засіданні вченої ради Д 35.368.01 в Інституті біології тварин УААН за адресою: 79034, Львів, вул. В. Стуса, 38
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біології тварин УААН (79034, Львів, вул. В. Стуса, 38)
Автореферат розісланий „___” _______________2005 р.
Вчений секретар спеціалізованої
вченої ради __________________________________________Віщур О.І.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. За умов зниження поголів’я великої рогатої худоби, яке спостерігається за останні десятиріччя, вирішального значення набуває підвищення здатності тварин до репродукції. Саме тому вивчення механізмів регуляції репродуктивної функції сільськогосподарських тварин належить до актуальних проблем сучасної фізіології та біохімії. Застосування нових гормональних препаратів і сучасних технологій дає можливість штучно викликати фізіологічну суперовуляцію та шляхом трансплантації отримати від генетично цінних тварин більшу кількість нащадків, порівняно з традиційними методами, і забезпечити створення високопродуктивних стад (Смолянінов Б.В., 1988; Завертяєв Б.П., 1989; Ернст Л.К., Прокофьєв М.І., 1995; Мадісон В.В., 1998; Безуглий М.Д., 2002; Буркат В.П., Влізло В.В., та ін., 2004). Однак, застосування гормональних препаратів має свої особливості, повўязані з непередбаченістю наслідків, які виникають після їх введення (Гуфрій Д.Ф., Канюка О.І., 2004).
Індукована гонадотропінами поліовуляція, при застосуванні технології ембріотрансплантації, супроводжується інтенсифікацією генеративних та метаболічних процесів, як в гонадах, так і у всьому організмі самок. У фізіолого-біохімічному плані такий індукований гормонами стан організму вивчений ще недостатньо. Дослідження, які з’явилися останніми роками, здебільшого, стосуються впливу великих доз гонадотропінів на морфологію яєчників, фолікуло- і оогенез (Шеремета В.І., 1999;), ембріопродукцію (Donaldson L.E., 1984; Chupin D., et al, 1984) та рівень окремих гормонів у крові (Juengel J.L., Haworth J.D., et al, 2000; Donaldson L.E., 1985;). Однак, вплив різних схем індукції поліовуляції на метаболічні процеси в організмі тварин вивчається мало.
У зв’язку з цим дослідження інтенсивності окисно-відновних процесів у мітохондріях тканин телиць і корів за умов поліовуляції, викликаної гонадотропінами, є актуальним завданням для з’ясування фізіолого-біохімічних механізмів дії цих препаратів. Проведення досліджень у такому плані має велике теоретичне та практичне значення.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Матеріали дисертаційної роботи є частиною науково-дослідної роботи сектору трансплантації ембріонів і лабораторії клітинної інженерії Укр. НДІ фізіології і біохімії с.-г. тварин (далі читати як Інститут біології тварин УААН) і виконувалась у межах таких завдань: „Удосконалити методи викликання суперовуляції у великої рогатої худоби” (№ держреєстрації ГР01880073896), 1986-1990 р.; „Вивчити шляхи підвищення рівня фолікулогенезу, оогенезу і приживлення ембріонів та вдосконалити метод індукції поліовуляції у телиць і корів донорів” (№ держреєстрації UА 01002231Р, 1990-1995 р), автор вивчав вплив поліовуляції, викликаної гонадотропінами, на рівень енергетичних процесів в мітохондріях тканин та вміст аскорбінової кислоти в тканинах що досліджувалися.
Мета і завдання дослідження: встановити рівень енергетичних процесів у мітохондріях, виділених із тканин, окремих вісцеральних органів статевозрілих телиць і корів за умов різних схем викликання поліовуляції гонадотропними препаратами.
Для досягнення мети дослідження поставлено такі завдання:
-дослідити вплив окремих гонадотропних препаратів на окисне фосфорилювання та активність ферментів термінального ланцюга в мітохондріях клітин репродуктивних органів, печінки, серцевого м’яза та надниркових залоз;
-визначити вміст аскорбінової кислоти в тканинах за умов гонадотропної поліовуляції;
-встановити ефективність різних схем індукції поліовуляції за морфометричними показниками в яєчниках та матці корів і телиць та кількістю вимитих, якісних, придатних для трансплантації ембріонів;
-оптимізувати існуючі та розробити нові схеми, що забезпечують високий рівень поліовуляції при менших затратах праці.
Об’єкт дослідження: морфофункціональні зміни матки, яєчників, печінки, серцевого м’яза, надниркових залоз корів і телиць за різних метаболічних станів.
Предмет досліджень: окисно-відновні процеси в мітохондріях тканин та рівень аскорбінової кислоти в окремих тканинах тварин за дії гонадотропних препаратів.
Методи досліджень: біохімічні - визначення кількості білка в мітохондріях та концентрації АК у тканинах; полярографічні - визначення інтенсивності окисного фосфорилювання (ОФ) і активності сукцинатдегідрогенази (СДГ), NADH- і цитохромоксидаз (ЦХО); мікроскопічні - пошук та оцінка вимитих ембріонів; морфометричні - визначення ваги матки, довжини, товщини їх рогів, кількості в яєчниках жовтих тіл та фолікулів; акушерсько-гінекологічні - ректальне дослідження функціонального стану репродуктивних органів.
Наукова новизна одержаних результатів. Уперше в дослідах in vivo доведено вплив суперовулюючих доз гонадотропних гормонів на процеси окиснення і фосфорилювання в мітохондріях клітин печінки, серцевого м’яза, ендометрію й надниркових залоз корів і телиць. Виявлено підвищений рівень енергетичних процесів, що супроводжується підвищенням інтенсивності поглинання О2 в позиції активного фосфорилювання (V3) і посиленням активності сукцинатдегідрогенази, NADH- і цитохромоксидази. Встановлено, що вміст аскорбінової кислоти в тканинах та репродуктивних органах змінюється залежно від генеративних змін яєчника. Крім того, з’ясовано переваги застосування комплексного гормонального препарату „Поліфол”, який містить гонадотропін та вітаміни А, D3, Е, у порівнянні з чистим фолікулостимулюючим гормоном (FSH), що дає можливість зменшити затрати праці майже в 3 рази і разом з цим знизити собівартість методу викликання поліовуляції у корів-донорів. До того ж, досліджено вплив додаткового введення мінерально-вітамінних добавок до раціону корів-донорів ембріонів великої рогатої худоби на рівень індукції поліовуляції.
Практичне значення. Удосконалено схеми викликання множинної овуляції у донорів ембріонів великої рогатої худоби, які дають можливість отримати значно більшу кількість повноцінних ембріонів при менших затратах праці. Доведено, що застосування комплексного гонадотропного препарату „Поліфол” в комбінації з вітамінами групи В, посилює овуляторні процеси та підвищує вихід придатних для трансплантації ембріонів.
Особистий внесок здобувача. Автор самостійно провів аналіз літератури, засвоїв методи і виконав експериментальні дослідження, проаналізував отримані результати, опублікував матеріали досліджень. Із спільних наукових дослідів і публікацій дисертант використав, за згодою співавторів, лише свою частину результатів.
Апробація результатів дисертації. Основні положення і результати досліджень доповідалися, обговорювалися та отримали загальне схвалення на щорічних звітних сесіях Інституту біології тварин УААН (1988-1995), міжнародних та республіканських конференціях: міжнародній конференції, присвяченій 80-річчю від дня народження доктора біологічних наук, професора, академіка П.З. Лагодюка (м. Львів, 2004); міжнародній науковій конференцїї, присвяченій 100-річчю від дня народження академіка ВАСГНІЛ Й.А. Даниленка „Наукові основи сучасних технологій виробництва продукції тваринництва” (м. Харків, 2003); науково-виробничій конференції „Новые методы селекции и биотехнологии в животноводстве” (м. Київ, 1991); республіканській науковій конференції „Біотехнологічні дослідження і перспективи їх розвитку”. (м. Львів, 1990); республіканській науковій конференції „Состояние и перспективы развития биотехнологии в животноводстве” (м. Харків, 1988).
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 15 наукових праць, з яких 5 статей у фахових виданнях, 1 авторське свідоцтво, 1 інформаційний листок.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, викладу результатів власних досліджень, узагальнення і обговорення, висновків, практичних пропозицій, додатків. Використано 264 літературних джерел, у т.ч. 130 зарубіжних. Робота викладена на 149 сторінках, ілюстрована 38 таблицями і 2 рисунками, які займають 17 сторінок.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріали і методи досліджень. Експериментальна частина роботи виконана на 47 телицях 16-18-місячного віку та 12 коровах 3-ї і 5-ї лактації чорно-рябої породи, з рівномірними статевими циклами, після гінекологічного обстеження, та встановлення функціонального стану яєчників і матки. Досліди проводились у господарствах Львівської та Тернопільської областей у весняно-літній період року. Морфометричні дослідження яєчників і матки проводили відразу після забою (на 7-у добу після осіменіння), фізіолого-біохімічні дослідження проводились в лабораторії біологічно активних речовин та генної інженерії Інституту біології тварин УААН. Було проведено 4 досліди.
Перший дослід проводився на 3 групах телиць-аналогів (16-18 місяців) по 4 тварини в кожній. Вивчали вплив фолікулостимулюючого гормону „фолікотропіну” (Чехія) та комплексного гормонально-вітамінного препарату „Поліфолу” - ліпосомальна емульсія, яка містить суперовулюючі дози „фолікотропіну” та вітаміни А, D3, Е, на інтенсивність ОФ в тканинах матки, печінки, серця і наднирників, статевозрілих телиць. Одночасно за морфометричними показниками оцінювали рівень поліовуляції.
Другий дослід проводився на 3 групах 16-18-місячних телиць-аналогів, по 5 тварин у групі. Вивчали вплив різних схем індукції поліовуляції, на тлі попереднього введення синтетичного аналога простагландину F2a - естрофану, та введення до раціону телиць 3-ї дослідної групи преміксу „Мікромаг” (PULMIX), що містить мікроелементи (мідь, марганець, кобальт, селен, молібден, йод та магній), на енергетичні процеси в мітохондріях клітин тканин, що досліджувалися, вміст аскорбінової кислоти (АК) у цих тканинах, а також рівень поліовуляції.
У третьому досліді вивчали рівень енергетичних процесів за умов поліовуляції, викликаної фолікотропіном на тлі введення до раціону b-каротину та преміксу „Мікромаг” у комплексі з b-каротином. Дослід проводився на 4 групах статевозрілих телиць-аналогів по 5 тварин у кожній.
У четвертому досліді вивчали вплив різних схем індукції поліовуляції комплексним гормонально-вітамінним препаратом „Поліфол” на енергетичні процеси, вміст аскорбінової кислоти в тканинах та ефективність поліовуляції. Дослід проведено на 3 групах корів по 4 тварини у кожній. Індукцію поліовуляції у тварин 1-ї групи проводили за 3-денною, а у тварин 2- і 3-ї груп за 2-денною схемою. Відмінність між 2-ю та 3-ю дослідними групами полягала в тому, що коровам 3-ї групи під час статевої охоти додатково вводили вітаміни групи В (В1, В2, В6, В12, фолієву і нікотинову кислоту) у терапевтичних дозах.
Мітохондрії виділяли методом, описаним Скулачовим (1962). Контроль за чистотою мітохондріальної фракції проводили під фазово-контрастним мікроскопом. Активність ОФ вивчали полярографічним методом на полярографі ЛП-7 (ЧССР) (Кондрашова, 1973), полярографічно визначали активність цитохром-С-оксидоредуктази (ЦХО) і NADH-оксидазної системи мітохондрій за методом Рахімова та співавт. (1977). Інтенсивність ОФ і активність вищеописаних оксидазних систем вимірювали в мкатомах O за 1 хв. на 1 мг білка. Вміст білка в мітохондріальній фракції визначали за методом Лоурі та співавт. (1951). Швидкість дихання мітохондрій реєстрували за різних метаболічних станів за Чансом (1956). Вміст аскорбінової кислоти в тканинах визначали за методом Роела в модифікації Савченко (1967).
Статистичну обробку одержаних результатів проводили за Стюдентом.
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Окисне фосфорилювання в мітохондріях ендометрію, печінки, серцевого мўяза і надниркових залоз статевозрілих телиць на тлі дії „Фолікотропіну” і „Поліфолу”. При аналізі полярограм було встановлено, що інтенсивне поглинання О2 мітохондріями ендометрію телиць 1-ї дослідної групи у позиції V3 після першого додавання АDP (аденозиндифосфат) викликало посилення інтенсивності ОФ (табл.1). У позиції V4 його підвищення було незначним у порівнянні з контрольною групою, що призвело до вірогідного зростання дихального контролю (ДК), який становив 2,13±0,08 проти 1,53±0,11 у контролі. Після повторного введення АDP інтенсивність ОФ також підвищувалась, а ДК був вищим, ніж в контрольній групі 1,93±0,21 проти 1,67±0,16 відповідно.
Процеси, які виявлялися у тварин 2-ї дослідної групи після першого введення АDP, були аналогічними. Дихальний контроль становив 2,07±0,25 проти 1,53±0,11. Після повторного введення АDP інтенсивність поглинання О2 дещо знизилась, однак це не відобразилось на ДК і становило 1,88±0,06 проти 1,67±0,16 в контролі. Як результат підвищеного і відносно стабільного рівня інтенсивності ОФ збільшувалась швидкість поглинання кисню мітохондріями матки після роз’єднання процесів окиснення і фосфорилювання 2,4-динітрофенолом (2,4-ДНФ). Це спостерігали у мітохондріях клітин матки тварин 1-ї і 2-ї дослідних груп.
Таблиця 1
Інтенсивність окиснювального фосфорилювання в мітохондріях тканин (мкатомів O /мг білка за 1 хв.), M±m, n=4
Примітка. Вірогідність відмінностей у значеннях показників між контрольною і дослідними групами тварин: Р<0,05 через*; Р<0,01 через**; Р<0,001 через***
У мітохондріях клітин печінки і міокарда виявляли аналогічні зміни. Перше і друге додавання АDP зумовило вірогідне (Р<0,001 і Р<0,01) підвищення інтенсивності дихання у тварин дослідних груп.Відповідно зростав і ДК. З посиленням окиснювальних процесів вірогідно збільшувалась і швидкість роз’єднання окиснення та фосфорилювання 2,4-ДНФ-ом, що свідчить про високий ступінь поєднання ОФ в мітохондріях клітин печінки та серцевого м’яза тварин 1-ї і 2-ї дослідних груп.
У тварин 1-ї та 2-ї дослідних груп у мітохондріях надниркових залоз виявлялось зниження інтенсивності ОФ порівняно з контролем більше, ніж у 2 рази. ДК після першого додавання АDP у телиць всіх груп знаходився на одному рівні. При роз’єднанні окиснення і фосфорилювання 2,4-ДНФ-ом у тварин дослідних груп виявляли зниження інтенсивності поглинання О2 майже в 2 рази порівняно з контрольною групою телиць.
Різні схеми індукції поліовуляції викликають помітні зміни у масі матки і яєчників та рівні фолікулогенезу. Зокрема, під впливом суперовулюючих доз фолікотропіну і „Поліфолу” відбувалось збільшення маси матки. Так, у телиць 1-ї дослідної групи вона збільшилась на 60 г, а у телиць 2-ї дослідної групи на 32 г у порівнянні з контрольною групою тварин і становила 380,51±19,18 і 352,57±37 проти 321,02±8,94 г відповідно. Аналогічну картину виявили при одержанні і вирахуванні відсоткового співвідношення сухої речовини матки.
Введення тваринам фолікотропіну та комплексного гормонально-вітамінного препарату „Поліфол” зумовило підвищення маси яєчників у 2-3,4 рази, найбільш виразно у тварин 1-ї дослідної групи. Збільшення маси яєчників у телиць дослідних груп супроводжувалось збільшенням кількості фолікулів (діаметром більше ніж 1,0 см) і жовтих тіл.
Отже, помітної різниці в інтенсивності тканинного дихання і фосфорилювання при введенні гонадотропінів різних лікарських форм не встановлено. Окиснювальні процеси в органах-мішенях і окремих вісцеральних органах телиць при стимуляції фолікотропіном і комплексним препаратом „Поліфол” супроводжувались помітним впливом на фолікулогенез в яєчниках.
Окисно-відновні процеси і рівень аскорбінової кислоти в мітохондріях тканин статевозрілих телиць при індукції поліовуляції на тлі попереднього введення простагландину F2a. У результаті полярографічного дослідження ОФ було встановлено, що введення фолікотропіну сприяло збільшенню поглинання О2 мітохондріями матки телиць 1-ї групи і зниженню його у телиць 2-ї і 3-ї групи, які отримували препарат у формі ліпосомальної емульсії (табл. 2).
Після першого додавання АDP у телиць 1-ї групи швидкість поглинання О2 була високою як в позиції V3, так і V4 , однак це не призвело до збільшення величини ДК в порівнянні з іншими групами: 1,93±0,08 проти 2,23±0,05 та 1,91±0,14 відповідно. Аналогічна картина спостерігалась і при повторному стимулюванні дихання додаванням АDP.
Таблиця 2
Інтенсивність окисного фосфорилювання у мітохондріях ендометрію
(мкатом O на 1 мг білка за 1 хв.), M±m, n=5
Примітки. У цій та наступних таблицях: 1) вірогідність відмінностей у значеннях показників між групами тварин Р<0,05 через*; Р<0,01 через**; Р<0,001 через***; 2) а – порівняння між першою і другою групою, б – порівняння між першою, і третьою групою, в – порівняння між другою і третьою групою.
У телиць 2-ї групи інтенсивність ОФ була значно нижчою, ніж в 1-ї, але зниження її у позиції V4 призвело до вірогідного збільшення показника ДК в порівнянні з тваринами інших груп і становило 2,23±0,05 (P< 0,05) проти 1,93±0,08 і 1,91±0,14.
Активність енергетичних процесів у телиць 3-ї групи, як після першого, так і після повторного додавання АDP була дещо вищою, ніж у телиць 2-ї групи, проте ДК був нижчим і знаходився приблизно на одному рівні з таким показником, як у 1-й групі.
Незважаючи на те, що інтенсивність ОФ у телиць 2-ї і 3-ї дослідних груп була нижчою, ніж у 1-й групі, активність поглинання О2 після роз’єднання ОФ 2,4-динітрофенолом вірогідно підвищувалась (P<0,05). Показники становили 31,23±2,3 і 26,49±0,88 проти 19,97±3,29 мкатом О/ мг білка за 1 хв. у телиць 1-ї групи, що вказує на високий ступінь поєднання окиснення та фосфорилювання в мітохондріях клітин ендометрію телиць цих дослідних груп.
Зміни активності ОФ супроводжувались відповідними змінами активності СДГ, NADH- і цитохромоксидазних систем дихального ланцюга мітохондрій досліджуваної тканини. Показники активності СДГ у мітохондріях клітин ендометрію телиць 1-ї та 2-ї груп вірогідно (P<0,01 та P<0,001) перевищували відповідний показник у телиць 3-ї групи, у яких поліовуляцію викликали на тлі згодовування преміксу „Мікромаг”. NADH-оксидазна активність у телиць 1-ї групи з високим ступенем вірогідності (P<0,001) перевищувала відповідний показник у телиць 2-ї та 3-ї груп і становила 137,32±2,36 проти 54,57±1,60 і 71,17±3,68 мкатом O на 1 мг білка за 1 хв. відповідно, а у телиць 3-ї групи була вірогідно вищою (P<0,01) за відповідну активність у телиць 2-ї групи. Активність ЦХО була найвищою у групі телиць, яким індукцію поліовуляції проводили фолікотропіном і з високим ступенем вірогідності (P < 0,001) перевищувала відповідну активність у мітохондріях ендометрію телиць 2-ї і 3-ї груп. Цитохромоксидазна активність у телиць 2-ї групи була вірогідно вищою (P < 0,05), ніж у телиць 3-ї групи, яким згодовували премікс „Мікромаг”.
Отже, більшість показників енергетичного обміну, що вивчались у нашому досліді, були вищими у телиць 1-ї дослідної групи, у яких індукцію поліовуляції викликали фолікотропіном, і у 2-ї групи телиць, у яких поліовуляцію викликали препаратом „Поліфол” за 3-денною схемою.
Певні зміни встановлені і при визначенні концентрації аскорбінової кислоти в тканинах органів, що досліджувались. Зокрема, у телиць 1-ї групи рівень АК в матці був найнижчим, тоді як у телиць 3-ї - найвищим, що пов’язано з рівнем біоенергетичних процесів у цьому органі, а також із тим, що телиці 3-ї групи одержували мінеральну добавку. Рівень АК коливався і в окремих структурах яєчників (строма і жовті тіла). Вміст її в стромі яєчників зменшувався у телиць тих груп, у яких збільшувалась кількість зрілих і лютеїнізуючих фолікулів. У жовтих тілах вміст АК був в 2-2,5 рази вищим, ніж в стромі яєчників телиць усіх дослідних груп, до того ж виявлений зв’язок між рівнем АК і кількістю жовтих тіл. Так, якщо у телиць 1-ї і 3-ї групи налічувалось 7 – 8 жовтих тіл, то і рівень АК становив 127 – 141 мкг %. У телиць 2-ї групи при 3 – 4 жовтих тілах рівень АК дорівнював 105,4 мкг %.
Отже, індукція поліовуляції гонадотропінами має перерозподільчий вплив на рівень АК в тканинах, зокрема в окремих структурах яєчника (строма, жовті тіла) концентрація АК залежить від рівня генеративних процесів, які відбуваються в цих органах.
Оцінюючи поліовуляційний ефект за кількістю жовтих тіл і фолікулів розміром >1,0 см слід зазначити, що найкращими були показники у телиць 3-ої групи. Кількість жовтих тіл становила 7,8 проти 6,8 та 4,6, а фолікулів >1,0 см 4,6 проти 2,2 і 1,4 у 1-й і 2-й групах. Незначна кількість фолікулів >1,0 см на 7-му добу після овуляції (при помітній поліовуляції у 2-й групі телиць) - позитивне явище, що вказує на припинення інтенсивного фолікулогенезу до початку лютеїнової фази циклу.
Отже, на основі морфологічно-генеративних змін в яєчнику можна сказати, що „Поліфол” діє на яєчник більш фізіологічно. Однак, за ефективністю поліовуляції, застосування „Поліфолу” на тлі згодовування преміксу „Мікромаг” було результативнішим. Попереднє введення естрофану сприяє рівномірній відповіді яєчників у телиць усіх трьох груп.
Окисновідновні процеси в мітохондріях тканин телиць при введенні ФСГ і на тлі згодовування в раціоні b-каротину та преміксу „Мікромаг” у комбінації з b-каротином. У мітохондріях гепатоцитів телиць 1-ї дослідної групи, яким вводили фолікотропін за класичною схемою, встановили зниження активності СДГ. Введення фолікотропіну телицям 2-ї і 3-ї груп на тлі додаткового введення до раціону b-каротину і преміксу „Мікромаг” зумовило вірогідне підвищення (P<0,001) активності СДГ у порівнянні з контрольними тваринами. Незначне підвищення NADH-оксидазної активності встановлено у гепатоцитах телиць 3-ї групи. ЦХО дихального ланцюга мітохондрій клітин печінки була вірогідно підвищеною в усіх дослідних групах (P<0,05 та P<0,001) в порівнянні з контрольною. В мітохондріях телиць 2-ї і 3-ї дослідних груп, яким додатково згодовували b-каротин і премікс „Мікромаг”, встановлено підвищення цитохромоксидазної активності у 3 рази.
Активність ферментних систем дихального ланцюга мітохондрій серцевого м’яза свідчить, що всі використані методи індукції поліовуляції вірогідно посилювали (P<0,05 та P<0,001) активність СДГ та NADH-оксидази порівняно з телицями контрольної групи. Високий рівень активності ЦХО встановлено в мітохондріях серцевого м’яза телиць 1-ї та 3-ї дослідних груп (P<0,001).
Вірогідне підвищення активності сукцинат- і NADH- оксидазних систем спостерігається у мітохондріях надниркових залоз телиць 2-ї і 3-ї дослідних груп (P<0,05 та P<0,001), індукцію поліовуляції в яких проводили на тлі додаткового введення до раціону b-каротину і преміксу „Мікромаг” з b-каротином.
Використання всіх схем індукції поліовуляції посилювало активність цитохромоксидазної системи. У телиць 1-ої дослідної групи ця активність зростала в два рази, а у 2-й і 3-й дослідних групах зростала у 4 рази.
Зміни активності ферментних систем дихального ланцюга мітохондрій тканин, що досліджувались, підтверджуються морфометричними змінами у матці і яєчниках телиць. Зокрема, значні зміни виявлені у масі яєчників, яка у телиць всіх дослідних груп збільшилась у 3-5 разів у порівнянні з телицями контрольної групи. У телиць 2-ї і 3-ї дослідних груп вона була трохи нижчою, ніж у телиць 1-ої дослідної групи. Разом з тим, є відмінності за виходом загальної кількості ембріонів у телиць різних груп. Так, у телиць 3-ї групи було вимито 9,75, у 2-ї – 8,2, а в 1-й – 6,0 ембріонів відповідно на одного донора.
Отже, введення фолікотропіну як на тлі згодовування b-каротину, так і преміксу „Мікромаг” з b-каротином, виявляє більшу ефективність на генеративні процеси в яєчниках і забезпечує повноцінне протікання фолікуло- та оогенезу.
Окисно-відновні процеси в мітохондріях тканин корів при різних схемах індукції поліовуляції „Поліфолом”. Дослід в якому застосовувалось 3- і 2-денне введення „Поліфолу” був проведений на коровах. З метою підвищення кількості якісних ембріонів під час охоти додатково вводили внутрішньом’язево вітаміни групи В.
Дані енергетичного стану мітохондрій ендометрію наведені в табл.3.
Таблиця 3
Інтенсивність окисного фосфорилювання у мітохондріях ендометрію
(мкатом O на 1 мг білка за 1 хв.), M±m, n=4
Проведені дослідження показали, що використання „Поліфолу” за 2-денною схемою (2-га група) зумовило вірогідне (Р<0,05) збільшення швидкості поглинання О2 в позиції активного стану мітохондрій V3, після першого додавання АDP і в позиції контрольованого стану V4. Кращі показники в порівнянні з коровами 1-ої групи спостерігались і у корів 3-ї групи, однак вони не були вірогідними. Різний рівень активності поглинання О2 в позиції V3 і V4 у тварин дослідних груп не призвів до зміни величини ДК в них, він був однаковим і становив 1,80±0,71; 1,77±0,08 і 1,89±0,07 в 1-й, 2-й і 3-й групах відповідно, що свідчить про приблизно однакову функціональну потужність мітохондрій.
Після повторного додавання АDP активність поглинання О2 мітохондріями клітин ендометрію з високим ступенем вірогідності (Р<0,001) була вищою у корів 2-ї групи як в позиції V3, так і в позиції V4. На тлі підвищення ОФ в мітохондріях клітин матки корів 2-ї і 3-ї груп спостерігалось посилення роз’єднаного 2,4-динітрофенолом дихання, що свідчить про наявність у мітохондріях міцного з’єднувального ефекту ОФ.
Вірогідне підвищення активності СДГ спостерігається у мітохондріях ендометрія телиць 2-ї і 3-ї дослідних груп (P<0,001 та P<0,05). Дводенна схема викликання суперовуляції у корів 2-ї групи зумовила незначне зниження активності NADH-оксидазної системи в порівнянні з тваринами 1-ї і 3-ї груп, проте аналогічна схема обробки корів 3-ї групи, але з додатковим введенням вітамінів групи В під час охоти, вірогідно підвищила активність цього ферменту більше ніж у 1,5 рази (Р<0,001) в порівнянні з 1-ю групою корів. У мітохондріях клітин ендометрію корів 3-ї групи підвищення активності ЦХО було вірогідним і становило відповідно 89,34±2,06 проти 83,07±2,08 і 85,05±3,06 мкатом О на 1 мг білка за 1 хв в клітинах ендометрію 1-ї і 2-ї груп.
Виявлено вірогідне посилення (Р<0,05) окисно-відновних процесів після першого додавання АДФ у мітохондріях клітин наднирників корів 2-ї і 3-ї дослідних груп в позиції активного стану мітохондрій V3 (табл. 4), проте підвищення активності поглинання О2 в позиції V4 у корів 3-ї групи призвело до зниження величини ДК у порівнянні з 1-ю і 2-ю групами корів.
Таблиця4
Інтенсивність окисного фосфорилювання у мітохондріях наднирників
(мкатом O на 1 мг білка за 1 хв), M±m, n=4
Швидкість дихання в роз’єднаному стані без фосфорилювання АDP була вірогідно вищою (Р<0,05 та Р<0,001) в мітохондріях досліджуваної тканини корів 1-ї і 2-ї груп по відношенню до відповідного показника в 3-й групі корів і складала 11,15±0,7 та 11,1±0,35 проти 7,7±0,43 мкатом О на 1 мг білка за 1 хв.
Відмінності у швидкості поглинання О2 в активному стані V3 при окисненні екзогенного сукцинату характеризують активність СДГ та інших оксидазних систем дихального ланцюга мітохондрій надниркових залоз. Вірогідне підвищення активності СДГ було виявлено у мітохондріях тварин 2-ї групи (Р<0,05), у яких індукцію поліовуляції проводили „Поліфолом” за 2-денною схемою. Активність NADH-оксидази вірогідно підвищувалась у мітохондріях тканин наднирників у корів 3-ї групи (P<0,05 та P<0,001), яким вводили додатково комплекс вітамінів групи В, у порівнянні з коровами 1-ї і 2-ї груп. Показники активності ЦХО 2-ї і 3-ї груп з високим ступенем вірогідності (P<0,001) перевищували відповідний показник у корів 1-ї групи.
Дослідження показали, що всі три схеми стимулювали поліовуляцію. Ефективність одержання ембріонів у 3 групах корів була майже однакова. Було одержано по 6 – 7 ембріонів на корову. Однак, трансферабельних ембріонів, у корів 2-ї і 3-ї груп одержано по 6,2 – 6,4 на корову-донора при 3,8 ембріона на корову-донора в 1-й дослідній групі. Відповідно у корів цих груп виявлено менше дегенерованих ембріонів і незапліднених яйцеклітин.
Отже, препарат „Поліфол” по-різному впливає на інтенсивність енергетичних процесів в мітохондріях тканин, що досліджувалися, а також на ефективність поліовуляції залежно від кратності і схеми його введення.
ВИСНОВКИ
У дисертаційній роботі узагальнено фізіолого-біохімічні аспекти впливу різних схем індукції поліовуляції на рівень енергетичних процесів та вміст аскорбінової кислоти у репродуктивних та окремих вісцеральних органах корів і телиць. Обґрунтовано і запропоновано можливість викликання поліовуляції за допомогою скорочених схем ін’єкцій комплексних гонадотропних препаратів, які уможливлюють отримання більшої кількості якісних ембріонів на одного донора в порівнянні з існуючими на теперішній час методами.
1. Введення „Поліфолу” у формі ліпосомальної емульсії для викликання суперовуляції у статевозрілих телиць забезпечує подібний до застосування FSH, за класичною схемою, вплив на рівень поліовуляції та окисне фосфорилювання в організмі тварин.
2. „Поліфол” на тлі додаткового згодовування протягом двох місяців преміксу „Мікромаг” меншою мірою активував вільне дихання, паралельно підвищуючи з’єднувальний ефект окиснення з фосфорилюванням, про що свідчить підвищення дихального контролю та активності стимульованого дихання 2,4-ДНФ-ом в мітохондріях клітин ендометрію.
3. Введення естрофану (синтетичного аналога простагландину F2a) за 24 години до першої ін’єкції як фолікотропіну, так і розробленого нами комплексного препарату „Поліфолу” посилює ефект поліовуляції, що супроводжується збільшенням в яєчниках кількості жовтих тіл та фолікулів малого діаметру (0,3 - 0,5 см) та зменшенням кількості фолікулів великого діаметру (> 1,0 см) на 7 - й день після викликання суперовуляції. Це свідчить про більш фізіологічну дію на яєчник препарату „Поліфол”.
4. Введення до раціону телиць b-каротину і b-каротину в комплексі з преміксом „Мікромаг” суттєво впливає на рівень поліовуляції, підвищуючи при цьому кількість якісних ембріонів на 50% і супроводжується підвищенням інтенсивності окисного фосфорилювання та активності сукцинатдегідрогенази, NADH- і цитохромоксидази дихального ланцюга мітохондрій клітин печінки, серцевого м’яза та надниркових залоз.
5. Застосування комплексного препарату „Поліфол” коровам-донорам ембріонів за скороченою схемою (2 дні) посилює інтенсивність окисного фосфорилювання та активність ферментних систем дихального ланцюга мітохондрій тканин, що досліджувались, при цьому підвищується вихід повноцінних ембріонів у розрахунку на одного донора.
6. Паралельне з „Поліфолом” додаткове введення комплексного вітамінного препарату (вітаміни групи В- В1; В2; В6; В12; фолієва і нікотинова кислота) підсилює специфічну дію гонадотропного препарату на функцію яєчників, підвищує рівень поліовуляції та вихід придатних для пересадки ембріонів. Виявлено підвищений рівень енергетичних процесів, що супроводжується підвищенням поглинання кисню в позиції активного фосфорилювання (V3) і посиленням активності сукцинатдегідрогенази (СДГ), NADH-оксидази і ЦХО (цитохромоксидаза).
7. Гонадотропні препарати сприяють перерозподілу аскорбінової кислоти в тканинах. Вміст аскорбінової кислоти (АК) в досліджуваних тканинах та окремих структурах яєчника (строма, жовте тіло) знаходиться в прямій залежності від активності ендокринної функції жовтих тіл, як тимчасових ендокринних залоз, та рівня енергетичних процесів. Інтенсивний лютеогенез призводить до накопичення АК в жовтому тілі та зменшення її в стромі і фолікулярній рідині.
ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ
1. Для викликання ефекту поліовуляції у корів і телиць доцільно застосовувати препарат „Поліфол” за 2-денною схемою з попереднім (за 24 години) однократним внутрішньом’язевим введенням естрофану (аналога простагландину F2a) в дозі - 250 мкг.
2. З метою викликання суперовуляції гонадотропні препарати рекомендовано використовувати на тлі додаткового згодовування b-каротину, а особливо в комплексі з преміксом „Мікромаг” в дозі: b-каротину- 400 мг і преміксу „Мікромаг”-50 г на добу, для одержання якісних ембріонів від корів-донорів.
СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
1.Сливчук Ю.І. Біоенергетичні процеси в тканинах вісцеральних органів корів за умов індукції поліовуляції // Науково-технічний бюлетень Інституту тваринництва УААН. - Харків, 2003. - Вип. 85. - С. 110-115.
2. Сливчук Ю.І. Вплив фолікотропіну і „Поліфолу” на окремі показники енергетичного обміну в деяких внутрішніх органах статевозрілих телиць. // Аграрний вісник Причорномор’я. Збірник наукових праць „Біологічні та сільськогосподарські науки”. - Одеса, 2004. - Вип. 23.- С. 167-173.
3. Сливчук Ю.І. Рівень аскорбінової кислоти в тканинах репродуктивних органів статевозрілих телиць при викликанні суперовуляції фолікотропіном // Науково-технічний бюлетень Інституту біології тварин. - Львів, 2004. -Вип. 5. - № 3. - С. 205-209.
4.Сливчук Ю.І., Бучко А.М., Ковалів Л.М. Окислювальні процеси в окремих тканинах телиць парувального віку при гормональній індукції поліовуляції // Науково-тех. бюлетень Інституту фізіології і біохімії тварин УААН. - Львів, 1993. -Вип. 1. - С. 52-55. (Дисертант брав участь у постановці експерименту, самостійно провів дослідження інтенсивності окисного фосфорилювання, узагальнив результати, підготував роботу до друку).
5. Сливчук Ю.І., Смолянінов Б.В. Активність ферментних систем дихального ланцюга мітохондрій тканин екстрагенітальних органів телиць при індукції поліовуляції фолікотропіном // Біологія тварин. - 2004. - Т. 6 - № 1-2. -С. 385-389. (Дисертант брав участь у постановці експерименту, самостійно провів дослідження активності СДГ, NADH- і цитохромоксидаз, узагальнив результати, провів статистичну обробку і підготував роботу до друку).
6. Способ вызывания полиовуляции у коров - доноров при трансплантации эмбрионов: А. с №1729352 СССР, МКИ А 01К67/02 /И.И. Розгони, Б.В. Смолянинов, Т.Я. Чорненький, А.М. Бучко, Д.Э. Кобулей, Ю.И. Слывчук (СССР). - №4351449/15; Заявл. 25.11.87; Опубл. 30.04.92, Бюл. № 16. - 8 с.
7. Гормональные методы индукции полиовуляции и качество эмбрионов / Л.Н. Ковалив, А.М. Бучко, Ю.И. Слывчук, Б.В. Смолянинов // Информационный листок, Львов, ЦНТИ - 1992. - 4 с.
8. Разработка эффективных схем вызывания множественной овуляции у коров-доноров при трансплантации эмбрионов /Б.В. Смолянинов, А.М. Бучко, Ю.И. Слывчук, Д.Э. Кобулей // Тез. докл. респ. науч. конф, „Состояние и перспективы развития биотехнологии в животноводстве”. - Харьков, 1988. - С. 102-103.
9. Вплив окремих гонадотропних препаратів на індукцію поліовуляції /Д.Е.Кобулей, Ю.І. Сливчук, Б.В. Смолянінов, В.М. Сухін // Зб. тез І Респ. наук. конф. „Біотехнологічні дослідження і перспективи їх розвитку”. - Львів, 1990. - С. 54-55.
10. Влияние содержания витамина А и каротина в крови коров-доноров, а также рН вымывной среды на качество и количество получаемых эмбрионов /Б.В. Смолянинов, А.М. Бучко, Д.Э. Кобулей, Ю.И. Слывчук // Материалы всесоюз. конф. „Физиология продуктивности животных – решения продуктивной программы СССР”. - Таллин, 1990. - С. 76-77.
11. Вплив гормональної індукції поліовуляції на окисне фосфорилювання в тканинах телиць парувального віку / Ю.І. Сливчук, А.М. Бучко, Б.В. Смолянінов, Д.Е. Кобулей // Зб. тез. І Респ. наук. конф. „Біотехнологічні дослід-ження і перспективи їх розвитку”. -Львів, 1990. - С. 64-65.
12. Влияние суперовуляции на биоэнергетические и синтетические процессы в некоторых висцеральных органах тёлок случного возраста / А.М. Бучко, Ю.И. Слывчук, Д.Э. Кобулей, И.И. Матлах // Сб. тез. науч.-произв. конф. „Новые методы селекции и биотехнологии в животноводстве”. - Киев, 1991. - Ч. 2. - С. 44.
13.Влияние бета-каротина и премикса „Микромаг” на биохимические процессы в репродуктивных органах, уровень полиовуляции и качество эмбрионов у тёлок / Л.Н. Ковалив, Д.Э. Кобулей, А.М. Бучко, Ю.И. Слывчук // Сб. тез. науч. конф. „Новые аспекты участия биологически активных веществ в регуляции метаболизма и продуктивности с.-х. животных”. - Боровск, 1991. - С. 98-99.
14.Влияние различных схем вызывания суперовуляции препаратами ФСГ на биоэнергетические процессы в организме тёлок случного возраста / А.М. Бучко, Л.М. Ковалив, Ю.И. Слывчук, Д.Э. Кобулей // Сб. тез. докл. „Использование гормональных препаратов в животноводстве”. - Дубровицы, 1991. - С. 124-125.
15.Інтенсивність окислювального фосфорилювання в окремих тканинах телиць при викликанні суперовуляції / А.М. Бучко, Ю.І. Сливчук, І.Й. Матлах, Л.М. Ковалів // Тези доп. І Укр.симп.по енокринол.тварин, - Львів, 1994. -С.30-31.
| 
