|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН І ГЕНЕТИКИ
РУЖИЦЬКА Ольга Миколаївна
УДК 633.11.111:581.48:518.14:577.115
ВМІСТ ТІОБАРБІТУРАТРЕАКТИВНИХ РЕЧОВИН В НАСІННІ ОЗИМОЇ ПШЕНИЦІ
В ЗВ’ЯЗКУ З ЙОГО ЖИТТЄЗДАТНІСТЮ ЗА РІЗНИХ УМОВ ЗБЕРІГАННЯ
03.00.12. – фізіологія рослин
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ-2002
Дисертацією є рукопис
Робота виконана на кафедрі ботаніки Одеського національного університету
ім. І. І. Мечникова Міністерства освіти і науки України, м. Одеса
Науковий керівник: доктор сільськогосподарських наук,
старший науковий співробітник
КІНДРУК Микола Онисимович,
Селекційно-генетичний інститут – Національний
Центр насіннєзнавства та сортовивчення УААН,
завідувач лабораторії насіннєзнавства і стандартизації
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор
ЯВОРСЬКА Вікторія Казимирівна,
Інститут фізіології рослин і генетики НАН України,
завідувач відділу росту і розвитку
доктор біологічних наук, доцент
КРЕСТІНКОВ Іван Спиридонович
Одеська державна академія харчових технологій,
професор кафедри технології зберігання харчових продуктів
та зернознавства
Провідна установа: Інститут клітинної біології і генетичної інженерії
НАН України, м. Київ
Захист дисертації відбудеться “__13__“ ____червня____ 2002 р. о __12___ год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.212.01 в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ, вул Васильківська, 31/17,
тел. 263-51-50
З дисертацією можна ознайомитися у науковій бібліотеці Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, Київ, вул Васильківська, 31/17.
Автореферат розіслано “ 3 “ ___травня_____ 2002 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Мордерер Є.Ю.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність проблеми. Вирішення питань, пов’язаних із вдосконаленням технології тривалого зберігання насіння зумовлено необхідністю збереження біологічного різноманіття рослинного світу. З′ясування механізмів мінливості життєздатності насіння в процесі його зберігання є важливим практично значимим завданням, а також представляє значний теоретичний інтерес, тому що насіння є зручним предметом для вивчення проблем старіння.
В літературі накопичено чималий матеріал, присвячений вивченню процесів, що відбуваються у насінні за його зберігання. Механізми старіння і втрати якості насіння пов′язують як із виснаженням запасів поживних речовин і нагромадженням різних отрут у ході метаболізму насіння, так і з деструкцією й денатурацією білків, вуглеводів, нуклеїнових кислот і ліпідів [Овчаров и др., 1978; Робертс, 1978; Криштофович, 1980; Vertucci, 1992; Ангелова, Холодова, 1993; Соколов, Сорочинский, 2001 та ін.]. Однак, процеси, результатом яких є погіршення життєздатності насіння, остаточно не розкриті. З′ясування цих питань ускладнюється тим, що первинні реакції за старіння насіння значно змінюються в залежності від умов зберігання. При дуже низькому вмісті води в насінні, що обмежує біохімічні реакції, в ньому можливі оксидативні реакції і реакції, що стимулюються світлом [Vertucci et al., 1987]. Вважають, що в процесі зберігання сухого насіння найбільш ймовірними чинниками процесу старіння є реакції вільнорадикального окиснення, які включають пероксидне окиснення ліпідів (ПОЛ) [WiIsоn, Mcdonald, 1986; Thompson, 1987; Khan et al., 1996; 1997]. Водночас динаміка інтенсивності процесів ПОЛ під час зберігання насіння більшості сільськогосподарських культур, зокрема пшениці, залишається мало дослідженою.
Чинники зовнішнього середовища, що діють на вегетуючі материнські рослини, багато в чому визначають посівні та врожайні властивості насіння [Строна, 1966; Остин, 1978; Макрушин, 1985; Киндрук, 1987]. Мінливість цих показників у насіння, вирощеного у різні за погодними умовами роки, перевищує навіть сортові відмінності. У зв'язку з цим дослідження життєздатності насіння озимої пшениці, отриманого у різні за метеорологічними умовами роки, та активності процесів ПОЛ в окремих його органах під час зберігання, які можна тестувати за рівнем тіобарбітуратреактивних речовин, є актуальними і дуже важливими для вдосконалення сучасної технології збереження та оцінки посівного матеріалу.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана як складова тем науково-дослідної роботи кафедри ботаніки ОНУ ім. І.І. Мечникова - “Еколого-біологічне вивчення надземної і водної флори Північно-Західного Причорномор′я з метою охорони, раціонального використання та управління продукційним процесом” та лабораторії насіннєзнавства і стандартизації Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення УААН – 04.02 “Розробити науково-обгрунтовані заходи по підвищенню й зберіганню сортових, посівних та врожайних якостей насіння”.
Мета та завдання досліджень. Метою роботи було вивчення мінливості та взаємозв′язку показників життєздатності й активності процесів ПОЛ (за вмістом тіобарбітуратреактивних речовин) в окремих органах насіння озимої пшениці різних років урожаю за різних умов зберігання.
Для досягнення мети вирішували такі задачі:
- визначити посівні якості, структуру та морфофізіологічні параметри проростків, а також вміст тіобарбітуратреактивних (ТБК-реактивних) речовин в окремих органах насіння, формування якого відбувалося за різних метеорологічних умов, та провести порівняльний аналіз його біологічних властивостей;
- дослідити динаміку посівних якостей, морфофізіологічних параметрів проростків, а також інтенсивності ПОЛ в окремих органах насіння різних років урожаю за його зберігання протягом 3-х років за контрольованих й неконтрольованих умов;
- дослідити посівні якості, структуру та морфофізіологічні параметри проростків, а також інтенсивність ПОЛ в насінні тих самих зразків за умов його штучного старіння та з'ясувати відповідність процесів, що відбуваються в насінні під час тривалого зберігання та штучного старіння;
- з'ясувати динаміку вмісту ТБК-реактивних речовин в окремих органах несхожих та життєздатних насінин протягом першої доби їх гідратації і на підставі отриманих результатів дати оцінку можливості розробки експрес-методу діагностики життєздатності насіння.
Об’єкт дослідження – життєздатність насіння пшениці за різних умов його зберігання.
Предмет дослідження – морфофізіологічні показники життєздатності та активність процесів ПОЛ в окремих органах насіння озимої м’якої пшениці за його зберігання та штучного старіння.
Методи дослідження – спектрофотометричний, колориметричний, ваговий методи, а також методи математичного аналізу отриманих даних.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше досліджена динаміка вмісту ТБК-реактивних речовин в окремих органах насінин озимої пшениці в процесі їх тривалого зберігання в різних умовах. Виявлено, що найбільшим вмістом ТБК-реактивних речовин, незалежно від умов вирощування, як на початку, так і впродовж зберігання насіння, характеризуються тканини зародка. Показано, що динамiка життєздатності насіння протягом 130-170 діб його штучного старіння аж до повної втрати схожості має певний періодичний характер і тісно пов'язана з активністю процесів ПОЛ у зародках зернівок. Вивчена динаміка вмісту ТБК-реактивних речовин в насінні озимої пшениці різної життєздатності за його бубнявіння і показано, що несхоже насіння відрізняється значно меншим вмістом продуктів ПОЛ у його окремих органах. Отримані результати свідчать про участь реакцій ПОЛ у регуляції початкових етапів проростання насіння.
Практичне значення одержаних результатів. Результати роботи поглиблюють сучасні уявлення щодо механізмів старіння насіння та доповнюють існуючі дані про вплив різноманітних чинників навколишнього середовища на життєздатність насінин. На підставі проведених досліджень по накопиченню тіобарбітуратреактивних речовин в насінні озимої пшениці різної схожості за його бубнявіння розроблено рекомендації щодо використання ТБК-тесту для оцінки життєздатності насіння озимої пшениці під час його зберігання. Запропонований тест використовується в лабораторії насіннєзнавства і стандартизації Селекційно-генетичного інституту - Національного центру насіннєзнавства та сортовивчення УААН при формуванні насіннєвих фондів та колекцій генотипів насіння озимої м′якої пшениці. Результати досліджень використовуються в науково-дослідній і навчальній роботі кафедри ботаніки Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова.
Особистий внесок здобувача. Автор особисто провела експериментальні дослідження, здійснила аналіз отриманих результатів, підготувала до друку публікації за темою дисертації. Текст дисертації та автореферату автором написані особисто, інтерпретація деяких окремих фактів та закономірностей подається з урахуванням порад та консультацій наукового керівника та інших фахівців.
Апробація роботи. Матеріали, викладені у дисертаційній роботі, були представлені на YII Молодіжній конференції ботаніків (С.-Петербург, 2000), міжнародній конференції “Онтогенез рослин в природному та трансформованому середовищі” (Львів, 1998), симпозіумі “Біологічні механізми старіння” (Харків, 1996), X з’їзді Українського ботанічного товариства “Проблеми ботаніки і мікології на порозі третього тисячоліття” (Полтава, 1997), XI з’їзді Українського ботанічного товариства (Харків, 2001).
Матеріали дисертації обговорено на наукових конференціях професорсько-викладацького складу і наукових працівників ОНУ (Одеса, 1996; 1998; 1999), YI Молодіжній конференції ботаніків (С.-Петербург, 1997), симпозіумі “Біологічні механізми старіння” (Харків, 1998), науково-практичній конференції “Хлібопродукти-97” (Одеса, 1997), науковій конференції “Актуальні питання аграрної та ботанічної науки” (Одеса, 1997), молодіжній конференції “Проблеми фізіології рослин та генетики на рубежі III-го тисячоліття” (Київ, 2000).
Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 13 праць, з них 3 статті у провідних фахових виданнях.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається з вступу, трьох розділів основної частини, висновків та рекомендацій, списку цитованої літератури (360 найменувань, з них 179 - іноземними мовами) та додатків. Дисертацію викладено на 186 сторінках друкарського тексту, з яких 17 сторінок займають 18 таблиць, 14 сторінок - 16 ілюстрацій, 36 сторінок - список літературних джерел, 18 сторінок - додатки.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Складається з трьох підрозділів, у яких розглядаються сучасні підходи до визначення та оцінки життєздатності насіння, проаналізовані дані про вплив різноманітних чинників на біологічні властивості насіння за його зберігання, висвітлені сучасні уявлення про виникнення та біологічну роль вільних радикалів у рослинному організмі.
ПРОГРАМА, УМОВИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Експериментальні дослідження проводили з 1996 по 2001 роки в лабораторії фізіології рослин кафедри ботаніки Одеського національного університету ім. І.І. Мечникова та лабораторії насіннєзнавства і стандартизації Селекційно–генетичного інституту – Національного центру насіннєзнавства і сортовивчення Української академії аграрних наук.
У дослідах використовували насіння озимої пшениці (Triticum aestivum L.) сорту Обрій, отримане у різні за метеорологічними умовами роки. Вивчення показників життєздатності та інших властивостей насіння проводили як за тривалого, так і прискореного (штучного) старіння.
Штучне старіння насіння викликали шляхом витримування його у герметичній склянці (200 см3) при 37 °С протягом 130-170 діб аж до повної втрати схожості. При тривалому зберіганні зразки насіння з природною вологістю (12,5-12,9 %), а також підсушені (вологість 7,5-7,9 %) затарювали в герметично запарафійовані пляшки та негерметичну упаковку (торби). Зберігали насіння протягом трьох років в контрольованих та неконтрольованих умовах. За першого варіанту збереження використовували кліматичну камеру ВКШ–73, налаштовану на температуру +4±1°С. Для зберігання зразків насіння в неконтрольованих умовах використовували складське приміщення (комора). Варіанти досліду були такі:
1– кліматична камера, герметична тара, підсушене насіння;
2– кліматична камера, герметична тара, непідсушене насіння;
3– кліматична камера, негерметична тара, непідсушене насіння;
4– комора, герметична тара, підсушене насіння;
5– комора, герметична тара, непідсушене насіння;
6– комора, негерметична тара, непідсушене насіння.
Під час зберігання у зразках насіння періодично (при штучному старінні через кожні 10 діб, при тривалому зберіганні - щорічно) для оцінки життєздатності насiння визначали енергію проростання і лабораторну схожість за ГОСТ 12038–84, силу росту за методиками С.П. Лифенка (1964) і Б.С. Ліхачова (1977), довжину паростків, суху масу паростків і корінців, а також для оцінки активності пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) вміст тіобарбітуратреактивних (ТБК–реактивних) речовин в окремих органах (частинах) зернівки. Вміст ТБК–реактивних речовин у пробах визначали за кольоровою реакцією з 2–тіобарбітуровою кислотою (2-ТБК) і розраховували на підставі результатів спектрофотометрії (СФ–46) з урахуванням коефіцієнту молярної екстинкції забарвленого комплексу (ε), що дорівнює – 1,55×105 см-1×М-1 [Владимиров, Арчаков, 1972; Мерзляк та ін., 1978]. Визначення вмісту ТБК–реактивних речовин проводили як в цілих насінинах, так і окремо в зародках та насінинах без зародків. У зразках тривалого зберігання, крім того, визначали вміст ексудативних цукрів за антроновим методом (Blazka, 1966), а також внутрішню загальну ураженість насіння грибковими хворобами методом його висіву на тверде живильне середовище [Наумова, 1960]. Отримані результати порівнювали з вихідними значеннями показників, які визначали перед закладанням насіння на зберігання. В окремій серії дослідів досліджували вміст ТБК–реактивних речовин в насінні різної життєздатності під час його бубнявіння та проростання. Оцінку метеорологічних чинників та потенційну продуктивність насіння, яке закладали на зберігання, проводили за методичними вказівками М.О. Кіндрука,
Л.К. Січняка і О.К. Слюсаренка (1987).
На рисунках і таблицях представлені середні арифметичні значення та їх стандартні похибки. Експерименти по визначенню посівних якостей насіння та біометричних параметрів проростків у кожній серії дослідів повторювали 3–4 рази, а по визначенню вмісту ТБК-реактивних речовин – 3–6 разів. Результати експериментів оброблені статистично [Лакин, 1990].
РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Вплив умов зберігання на білогічні властивості насіння
врожаю різних років
Мінливість посівних якостей та морфофізіологічних показників насіння під час його зберігання. Оцінка умов вирощування, визначення посівних якостей та інших показників насіння показала, що внаслідок дії екологічних чинників насінню озимої пшениці сорту Обрій урожаю різних років властивий неоднаковий рівень життєздатності й вмісту ТБК–реактивних речовин.
Найменший ступінь життєздатності на початку зберігання був властивий насінню, отриманому в 1996 році (табл. 1). Погоднi умови в період від колосіння до молочної стиглості у 1996 році визначалися більш високою температурою повітря та низькою кількістю опадів у порівнянні з оптимальними умовами вегетації рослин у цей період. Насіння врожаю 1997 року мало найкращі показники якості, а показники насіння того ж сорту врожаїв 1993 та 1998 років займали проміжне положення між відповідними показниками насіння 1997 і 1996 років.
Таблиця 1
Зміни посівних та морфофізіологічних показників насіння пшениці після 3-х років зберігання у різних умовах
Примітка: : * - різниця достовірна при р<0,05;
** - - “” - р<0,01;
*** - - “” - р<0,001.
Умови середовища, в яких формувалося насіння, значною мірою впливали на стан його життєздатності і впродовж зберігання (табл. 1). Як свідчать наведені результати, за три роки зберігання в негерметичній упаковці в приміщенні з нерегульованими умовами насіння повністю втрачало життєздатність (варіант 6). Якщо насіння з природною вологістю зберігали за тих же умов температури, але в герметичній тарі, то строк збереження його життєздатності значно збільшувався. Так, у насіння врожаю 1997 року за трирічний термін його зберігання в герметичній тарі схожість практично не змінилася, тоді як у насіння врожаю 1996 року за той же строк зберігання даний показник зменшився на 19 %. Велика різниця в життєздатності насіння, отриманого від рослин, вирощених у різні роки, спостерігалась і під час зберігання при постійній температурі в камері (+4 °С). Після 3-х років зберігання в негерметичній тарі в камері схожість насіння врожаю 1997 року залишилася на вихідному рівні, а сформованого в 1996 році зменшилася на 39%. Використання герметичної тари сприяло збереженню життєздатності насіння врожаю 1996 року і 79 % цього насіння після трирічного зберігання виявилося схожим.
Характер змін в енергії проростання і силі росту насіння залежно від умов формування і зберігання корелює із змінами його схожості, але слід відзначити більш різке зниження сили росту, особливо в насінні, вирощеному у посушливому (1996) році.
За кількістю ексудативних цукрів у витяжках та внутрішньою загальною ураженістю грибковими хворобами насіння врожаю різних років значно відрізнялось як на початку, так і в процесі зберігання. Протягом трьох років зазначені показники варіювали не залежно від умов зберігання насіння. Використання негерметичної тари за нерегульованих умов зберігання насіння призвело до повної втрати його схожості, однак більш виразного внутрішнього ураження цього насіння патогенними грибами не було виявлено.
Середня довжина паростків, що визначається до початку автотрофного живлення, може слугувати мірою інтенсивності метаболічних процесів у насінні за його проростання. Як видно з наведених даних, через три роки зберігання насіння з вихідною вологістю в герметичній тарі при постійній температурі +4 °С середня довжина пагонів у його проростків істотно не відрізнялася від вихідного значення. За тих же умов температури, але негерметичної тари, середня довжина пагонів у проростків насіння врожаю 1996 року зменшувалася на 23 %, а у проростків насіння врожаю 1997 року не змінювалася. При зберіганні за тих же температурних умов підсушеного насіння середня довжина пагонів у проростків насіння врожаю 1997 року не змінилася, а у проростків насіння, отриманого в 1996 році, зменшилася в середньому на 24 %. Характер змін цього параметра при зберіганні підсушеного насіння в умовах комори (4-й варіант) відповідає тим змінам, які спостерігалися після зберігання насіння у камері (1-й варіант). Протилежно до цього, при зберіганні непідсушеного насіння у герметичній тарі в коморі (5-й варіант) середня довжина пагонів була значно меншою, ніж після збереження насіння у камері (2-й варіант).
Особливості внутрішньої структури певної партії чи зразку насіння, ступінь їх різноякісності відображають показники варіації, зокрема, коефіцієнт варіації. Визначення коефіцієнта варіації довжини пагонів у проростків насіння показало, що зберігання останнього супроводжується значним збільшенням цього показника, особливо у випадку отримання насіння у посушливий рік.
Ефективність підсушування насіння щодо збереження його життєздатності була різною, якщо досліджуване насіння отримували у різні роки за різних метеорологічних умов. Підсушування насіння врожаю 1996 року до вологості 7,5 % сприяло кращому його зберіганню в неконтрольованих умовах, в той час як його зберігання за постійної пониженої температури не виявляло помітних переваг процедури підсушування.
Проведені дослідження показали, що за три роки зберігання в окремих зразках відбувається не тільки зменшення схожості насіння, але й падає рівень метаболічних процесів за проростання, про що свідчить зниження таких показників як енергія проростання, сила росту, середня довжина пагонів.
Дослідження вмісту ТБК-реактивних речовин в насінні за різних умов його зберігання. Відомо, що негативні процеси, які обумовлюють старіння насіння, багато в чому пов′язані зі змінами інтенсивності вільнорадикальних процесів, зокрема пероксидного окиснення ліпідів (ПОЛ) [Thompson, 1987; Крестінков, 1994; Hendry, Athrton et al., 1994]. За результатами багатьох досліджень [Ланкин и др., 1975; Мерзляк и др., 1978; Khan et al., 1996], інтегральним показником, що характеризує активність процесів ПОЛ, може слугувати вміст в тканинах продуктів, що утворюють за певних умов забарвлений комплекс із 2-тіобарбітуровою кислотою, - ТБК-реактивних речовин.
Визначення вмісту ТБК-реактивних речовин у процесі зберігання насіння показало, що протягом 3-х років в ньому відбуваються зміни рівня ПОЛ, характер і ступінь яких у різних умовах зберігання неоднакові (рис. 1).
Як свідчать наведені результати, активність процесів ПОЛ у насінні з часом змінювалась. Так, зберігання протягом 2-х років невисушеного насіння врожаю 1997 року у герметичній тарі і в камері супроводжувалось збільшенням вмісту ТБК-реактивних речовин у зародках і зернівках без зародків (на 83 % і 43 % відповідно). Після ще одного року зберігання вміст зазначених речовин в органах насінини знизився, але теж виявлявся вищим (на 24 % і 40 % відповідно), ніж на початку зберігання. Отже, найвищий рівень ПОЛ у насінні спостерігався після двох років його зберігання. Така ж динаміка вмісту ТБК-реактивних речовин виявлялася у насінні врожаїв інших років. Водночас, насіння врожаю 1996 року під час зберігання відрізнялося більш виразними змінами вмісту ТБК-реактивних речовин в окремих органах насінин.
Зміни вмісту досліджуваних речовин у зародках за своїм напрямком відповідали тим, що спостерігалися в зернівках без зародків, але рівень їх накопичення у цьому органі насінини був значно вищим. Виявлені відмінності у зростанні вмісту ТБК-реактивних речовин в окремих органах насінини можуть бути пов'язані із змінами у фракційному складі ліпідів у цих структурах за зберігання насіння. Так, Е. Криштофовичем і Н. Покровською (1979) показано, що в зародку насінини пшениці збільшення рівня вільних жирних кислот відбувається більш інтенсивно, ніж в ендоспермі.
Рис. 1. Динаміка вмісту ТБК-реактивних речовин в насінні з урожаю 1997 року під час його зберігання в різних умовах, % від вихідного значення. Примітка: I - цілі зернівки; II – зернівки без зародка; III – зародки. А - герметична тара (підсушене насіння); Б - герметична тара (непідсушене насіння); В - негерметична тара (непідсушене насіння). 1, 2, 3, - роки зберігання.
Згідно з отриманими даними, на характер змін рівня ПОЛ у насінні впливає спосіб його зберігання. Характер мінливості вмісту ТБК-реактивних речовин у насінні, що зберігалося непідсушеним в герметичній упаковці за неконтрольованих температурних умов, відповідав тому, що спостерігався при зберіганні насіння у камері. Однак, характер змін рівня ПОЛ під час зберігання насіння в негерметичній упаковці в коморі (6-й варіант) відрізняється від характеру змін у насінні, яке зберігалося за більш сприятливих умов (3-й варіант). Як видно з наведених даних, після 3-х років зберігання в негерметичній упаковці у насінні, що зберігалося за постійної температури в камері (3-й варіант), вміст ТБК-реактивних речовин був значно більшим, нiж у насiнні, яке витримували той же час у коморі (6-й варiант).
Таким чином, насінню, що втратило посівні якості внаслідок несприятливих умов зберігання (в коморі і в негерметичній тарі), властивий менший вміст ТБК-реактивних речовин, ніж життєздатному насінню.
Біологічні властивості насіння озимої пшениці врожаю різних років
у процесі штучного старіння
Зміни посівних якостей та структури проростків насіння. Як свiдчать наведенi результати (рис. 2), насіння досліджуваних зразків в умовах штучного старiння зберігало життєздатність протягом різних термінів. У насіння, отриманого в 1997 роцi, повна втрата схожості наставала після 170 діб старіння. Формування насіння в несприятливих метеорологічних умовах скорочувало період збереження його життєздатності – повна втрата схожості у насiння врожаю 1996 року виявилась уже після 130 діб.
| 
