|
Українська Академія Аграрних Наук
Державний Нікітський ботанічний сад
Карпов Павло Андрійович
УДК 582.572.228: 581.16: 573.6: 581.19
БІОЛОГІЧНІ ОСОБЛИВОСТІ Yucca torreyI Shafer.: РОЗМНОЖЕННЯ РОСЛИН І ОДЕРЖАННЯ СТЕРОЇДНИХ ГЛІКОЗИДІВ in situ ТА in vitro
03.00. 20 - біотехнологія
АВТОРЕФЕРАТ
Дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Ялта - 2000
Дисертація є рукописом
Робота виконана у відділі експериментальної біології Державного Нікітського ботанічного саду УААН
Захист відбудеться 26 травня 2000 р. о 13:00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.369.01 при Державному Нікітському ботанічному саді УААН за адресою: 98648, Крим, м. Ялта, Державний Нікітський ботанічний сад УААН.
З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Державного Нікітського ботанічного саду УААН за адресою:
98648, Крим, м. Ялта, Державний Нікітський ботанічний сад УААН.
Автореферат розісланий "22" квітня 2000р.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Представники виду Yucca L. з давніх-давен знаходили широке господарське застосування, а в другій половині XX сторіччя стали активно використовуватися як цінні джерела стероїдних глікозидів. (Cruse et al., 1973) Згідно з літературними даними, стероїдні глікозиди (СГ) досліджені у 16 представників роду.
За останніми даними рід Yucca L. нараховує 42 види, 12 з яких представлені в Арборетумі ДНБС. Серед них Y. torreyi Shafer. є найбільш великою і високодекоративною.
Yucca torreyi Shafer. (син. Y. macrocarpa Engelm.) - невелике дерево, росте тільки на південному заході Техаса, значно південно-східніше Нью-Мехіко, з ареалом, що простягається вглиб Мексіки.
На півдні України юкки широко використовуються в декоративному садівництві, проте впровадження Y. torreyi як декоративної і лікарської рослини стримується із-за відсутності запилювача (Tegeticula yuccasella), що утруднює одержання насіння. Традиційні способи вегетативного розмноження малоефективні і не застосовуються до таких великих видів як Y. torreyi. (Голубєв та ін., 1973)
Досягнення останніх років в галузі культури органів і тканин продемонстрували величезну можливість клітинних технологій як в розмноженні цінних генотипів, так і в одержанні біологічно активних речовин. (Носов, 1992; Бутенко, 1999) Методи клонального мікророзмноження були розроблені для Y. elephantipes Regel. (Pierik, et al., 1983) і Y. schidigera (Kaneda et al., 1987). Дані про використання біотехнологічних методів в розмноженні та одержанні стероїдних глікозидів Y. torreyi в літературі відсутні.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконувалися у відділі експериментальної біології Державного Нікітського ботанічного саду НАН України, в період з 1997 по 1999рр. у відповідності з розділом тематичного плану № 0197U004314 - "Вивчити фізіолого-біохімічні основи адаптації плодових і декоративних культур з метою оптимізації продукційного процесу і розробки теоретичних аспектів селекції екологічно стійких форм", а також планом аспірантської підготовки.
Мета і завдання досліджень. Метою даної роботи є вивчення біологічних і біохімічних особливостей рослин Y. torreyi інтродукованих в Нікітський ботанічний сад, можливості їхнього насінного і клонального мікророзмноження, а також визначення здатності рослин різного віку, культури клітин і тканин in vitro синтезувати стероїдні глікозиди. В ході роботи необхідно було вирішити такі завдання:
- Вивчити морфобіологічні і біометричні особливості плодів і насіння Y. torreyi, одержаних при штучному запиленні в умовах інтродукції на Південному Березі Криму і виявити взаємозв'язок з розвитком проростків in vivo та in vitro.
- Підібрати оптимальні умови для індукції адвентивного пагоноутворення in vitro в культурі епікотилю Y. torreyi. Розробити спосіб мікророзмноження рослин в умовах in vitro.
- Індукувати калюсоутворення з різних експлантів Yucca torrei і виявити здатність калюсу синтезувати стероїдні глікозиди; встановити взаємозв'язок їхнього синтезу з гістогенезом і морфогенезом.
- Відібрати калюс, що має здатність синтезувати СГ при відсутності виражених ознак гістогенезу і морфогенезу і провести його цитоморфометричний аналіз.
- Визначити місце первинного синтезу СГ в культурі ізольованих органів і тканин in vitro.
- Провести методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) порівняльне вивчення вмісту СГ у вегетативних і репродуктивних органах і тканинах рослин Y. torreyi, здатних і не здатних зав'язувати повноцінні плоди і насіння при штучному запиленні в умовах інтродукції на ПБК, а також в ювенільних рослинах різного віку.
Наукова новизна роботи. Вперше визначені кореляції між морфометричними характеристиками насіння і плодів, одержаних при штучному запиленні. В процесі вивчення потенційних можливостей насінного розмноження Y. torreyi встановлений взаємозв'язок морфо-логічних і вагових характеристик насіння з їхньою схожістю. Показана залежність схожості насіння Y. torreyi in vivo та in vitro з його виповненням, строками і умовами зберігання. Визначені стадії розвитку проростків Y. torreyi і їхня тривалість в умовах in situ та in vitro. Досліджена здатність калюсу різного походження синтезувати стероїдні глікозиди. Виявлений взаємозв'язок початку синтезу СГ в культурах калюсу з гістогенезом і морфогенезом. Одержаний калюс Y. torreyi, що синтезує СГ при відсутності ознак гістогенезу і проведений його цитоморфометричний аналіз. Вперше визначені три шляхи індукції утворення адвентивних пагонів Y. torreyi і розроблені два способи одержання рослин в умовах in vitro. Виявлені СГ у вегетативних і репродуктивних органах в умовах in situ. Визначений їхній максимальний вміст в насінні і встановлена хімічна структура переважного глікозида.
Практичне значення одержаних результатів. Дані, одержані внаслідок морфологічного і морфометричного аналізу плодів і насіння Y. torreyi, мають значення при відборі посівного матеріалу. Встановлено, що насіння Y. torreyi, яке знаходиться в плодах, зберігає схожість більш тривалий час, ніж ізольоване насіння в паперових пакетах.
Розроблені три шляхи індукції адвентивного пагоноутворення Y. torreyi, що дозволяють за один цикл вирощування (1-2 місяці) одержувати від материнського пагона 7 дочірніх. Визначені живильне середовище для укорінення мікропагонів і умови адаптації in vivo рослин, одержаних in vitro. Застосування способу клонального мікророзмноження дає високий вихід рослин у порівнянні з традиційними способами насінного і вегетативного розмноження Y. torreyi, що має яскраво виражене апікальне домінування.
Проведені дослідження з аналізу СГ в органах і тканинах рослин Y. torreyi є основою для подальших більш глибоких хімічних і фарма-кологічних досліджень, а виявлені закономірності синтезу СГ в культурах ізольованих органів і тканин є основою для розробки моделі виробництва СГ біотехнологічними методами.
Особистий внесок пошукача полягає в самостійному зборі рослинного матеріалу, постановці експериментів та обробці одержаних даних, аналізі літератури, підготовці і написанні наукових статей, оформленні дисертаційної роботи. Разом з науковим керівником проведені вибір об'єктів досліджень, освоєння методик і розробка структури дисертаційної роботи.
Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на міжнародних конференціях: на сесії ради Ботанічних садів України "Ботанічні сади - центри збереження біологічної різноманітності світової флори" (Ялта, 1995); конференції країн СНД "Інтродукція лікарських нетрадиційних культур" (Крим, Алушта, 1995); 2-му міжнародному симпозіумі присв'яченому 200-річчю дендрологічного парку “Софіївка” "Старовинні парки і проблеми їхнього збереження" (Умань, 1996); "Четверта міжнародна конференція з медичної ботаніки" (Київ, 1997); на VII Міжнародній конференції "In vitro Plant Cell Biology, Biotechnology and Germplasm Preservation" (Москва, 1997); "II International Symposium on Plant Biotecnology" (Kyiv, 1998); "Інтродукція рослин і віддалена гібридизація" (Москва, 1998); 7 International Meeting of Young Scientists in Horticulture (Lednice, Czech Republic, 1999).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 робіт, з них 4-статті в спеціалізованих наукових виданнях і 8 - матеріали і тези наукових конференцій.
Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, 6 розділів, висновків і переліку цитованої літератури, що включає 247 джерел, в тому числі 162 зарубіжних авторів. Робота викладена на 173 сторінках машинописного тексту і містить 58 рисунків, 28 таблиць.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Проведений аналіз даних, опублікованих у вітчизняній і зарубіжній літературі з біології представників р. Yucca L., біології їхнього насінного розмноження in vivo, in situ та in vitro, а також літератури, присвяченої клональному мікророзмноженню представників Yucca sp. in vitro. Опрацьована література, присв'ячена вивченню стероїдних глікозидів представників р. Yucca L. в умовах in vivo та in vitro і господарському застосуванню юкк. Проведений аналіз літератури, присв'яченої виробництву стероїдних глікозидів методами сучасної біотехнології.
РОЗДІЛ 2. ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ
2.1. Об'єкти дослідження
Як об'єкти дослідження були використані органи і тканини рослин Yucca torreyi Shafer., що ростуть в арборетумі ДНБС були розділені на здатні зав'язувати плоди і давати повноцінне насіння, не здатні зав'язувати плоди і насіння, а також ювенільні рослини різного віку.
2.2. Матеріали і методи досліджень
При проведенні досліджень і постановці дослідів дотримувалися методів, прийнятих в біотехнології, біохімії, ботаніці. Насіння Y. torreyi було одержано при штучному запиленні (гейтоногенії) з урахуванням рекомендацій Ф.М. Русанова (1959), В.М. Голубєва та ін. (1973), О.П. Максимова та ін., (1989).
Визначення СГ проводили методом ТШХ на пластинах Silufol UV-254, Silufol UV-366 (фірма "Kavaler", Чехія) в системі n-бутанол: етанол: аміак (7:2:5) згідно з загальноприйнятою методикою (Кинтя та ін., 1979, 1987; Зураб'ян, 1989; Hostettman & Marston, 1995). Як проявники використовували фосфорно-вольфрамову кислоту і реактив Ерліха. Аналіз структури переважного глікозида насіння проводився з залученням ЯМР - і 13С-спектроскопій.
Гістохімічне визначення СГ проводили на свіжому матеріалі (Brunarska et al., 1978; Гурієлідзе та ін., 1992) за допомогою реактивів Саньє (Sannie et al., 1975) на олігоспіростанозиди (ССГ), Ерліха (Kiyosawa et al., 1968) на олігофуростанозиди (ФСГ) і Лафона (Brunarska et al., 1978) на загальні сапоніни. Створення бібліотеки цифрових зображень хроматограм і відтисків зрізів листків виконували методом комп'ютерного сканування з застосуванням сканерів PRIMAX Colorado 600p і PRIMAX Colorado C4800 при оптичному дозволі 400 dpi з застосуванням інтерполяризації.
Приготування тимчасових препаратів і цитометричні дослідження проводилися за загальноприйнятою методикою (Паушева, 1980).
При одержанні асептичної культури, органів, тканин рослин Y. torreyi дотримувалися як прийнятих в біотехнології методів (Бутенко, 1964, 1999; Здруйковська-Ріхтер, 1974; Калінін та ін., 1980, 1992; Катаєва, Бутенко, 1983; George et al., 1987; Dixon & Gonzales, 1994; Gamborg & Phillips, 1995), так і методів, розроблених у відділах експериментальної біології і біотехнології ДНБС. Як первинні експланти були використані насіння місцевої репродукції та ізольовані з них зіготичні зародки.
Асептичну роботу проводили в ламінар-боксі БП-4-004. Культивування in vitro здійснювалося на модифікованих живильних середовищах МС (Murashige & Skoog, 1962) і QL (Quoirin & Lepoivre, 1977), а також на середовищах, що містять повну і половини концентрації макро- і мікросолей.
Експланти культивували в колбах Елемеєра об'ємом 300мл (Німеччина), на СПВР, при 24-28°С і 16-годинному фотоперіоді. Освітлення здійснювали за допомогою люмінісцентних ламп ЛФР-150. Періодичність субкультивування складала 2-3 місяці.
Для дослідження процесів морфогенезу в живильні середовища вводили фітогормони: БАП, ІОК, ІМК, НОК, 2.4-Д. При проведенні дослідів з індукції закладки адвентивних бруньок, епікотили проростків, одержаних в асептичних умовах на середовищі МС (1962), що не містило фітогормони, поміщали на агаризовані середовища МС і QL, що містили різні концентрації і співвідношення НОК (0; 0.1; 0.4; 1.0; 2.0; 3.0; 10.0 мг/л) і 6-БАП (0; 0.1; 0.4; 1.0; 2.0; 3.0; 10.0 мг/л).
Статистичну обробку даних проводили за допомогою програми STATISTICA for Windows 5.1С, Copyright© StatSoft, Inc. 1984-1996 (WEB: http:/www. statsoftinc. com) Кореляційні залежності оцінювалися на основі лінійного коефіцієнта кореляції за Пірсоном (r) (Лакін, 1973).
РОЗДІЛ 3. БІОМОРФОЛОГіЧні дослідження плодів, насіння І проростків Yucca torreyi Shafer. В зв'язку з насінним
Розмноженням в умовах інтродукції
3.1. Біоморфометричні характеристики плодів і насіння Y. torreyi
В ході досліджень, що проводилися, плоди і насіння були одержані при штучному запиленні шляхом гейтоногенії в 1994, 1996 та 1997 роках.
3.1. 1. Корелятивні зв'язки біометричних параметрів плодів
Довжина і діаметр плодів варіювали від 4,5см до 10см і від 1,8см до 3см відповідно. При цьому маса плодів становила від 6,12 г до 20,07 г і залежала від кількості насіння, яка варіювала від 9шт до 59шт. При обчисленні корелятивних зв'язків між такими біометричними параметрами плодів як маса, довжина і ширина, виявлений позитивний зв'язок, що підтверджується значеннями і величинами коефіцієнтів кореляцій. Для маси і довжини плодів r=0,99, а для маси і діаметра плодів r=0,91. Таким чином, маса плоду знаходиться у вираженому прямому корелятивному зв'язку з його лінійними розмірами, які також позитивно корелюють між собою (r=0,90)
- Біоморфометричні властивості насіння Y. torreyi і їхній взаємозв'язок з біоморфометричними показниками плодів і схожістю
Для Y. torreyi характерне велике, чорне насіння. Вага 1000 насінин Yucca torrei становила 147.6 г.
Вагові характеристики насіння варіювали в різні роки (Табл.1). Їхня маса вкладалася в нормальний розподіл. Аналіз вагових біометричних показників плодів і насіння з них (Табл.2) виявив кореляційну залежність між параметрами плоду і показниками насіння і їхній зв'язок з схожістю (Табл.3).
Таблиця 1 - Вагові характеристики насіння трьох урожаїв
Таблиця 2 - Вагові біометричні показники плодів і
насіння урожаю 1997 року
Таблиця 3 - Значення коефіцієнтів кореляції (r) біометричних
показників плодів і ізольованого з них насіння
Зі збільшенням у плоді Y. torreyi числа насіння, відбувається паралельне збільшення їхньої маси, хоча останній показник помітно відстає (r=0,22). В свою чергу, кількість виповненого насіння чітко позитивно корелювала з числом насіння що зійшло (r=0,99). Виражена позитивна кореляція також виявлена між вагою насіння і їхньою схожістю (r=0,89). На основі виявлених кореляційних зв'язків встановлено, що при максимальному зав'язуванні насіння в плоді Y. torreyi їхні посівні якості знижуються і кращим є насіння з плодів, виповнених не більше ніж на 70-80%. Мабуть це пов'язано з тим, що в природі 20-40% насіння, що розвивається, поїдається гусеницями запилювача. Внаслідок чого відбувається розвантаження плоду і перерозподіл живильних речовин.
РОЗДІЛ 4. Морфогенетичні потенції органів і тканин Yucca torrei В умовах in vitro в зв'язку з мікророзмноженням
3.1. 3. Морфологія проростків Y. torreyi in vivo та in vitro
Схожість свіжозібраного насіння становила 95-98%. При зберіганні його в паперових пакетах вона швидко падала і до кінця другого року практично втрачалася. Проте при зберіганні насіння всередині плодів схожість становила 70-80%. (Рис.1)
В процесі вивчення розвитку проростків на ранніх етапах онтогенезу з свіжозібраного морфологічно виповненого насіння в умовах in vivo та in vitro, було виявлено 7 стадій (I, II, III,..., VII), причому тривалість відповідних стадій в умовах in vitro була вище, ніж in vivo (Рис. 2).
Показано, що кількість насіння, що зійшла в умовах in vivo становила 89-95%. Проте, при введе-нні в культуру in vitro ізольованих зіготичних зародків відзначали їхню більш друж-ну, 100%-ну схо-жість.
Рис. 2. Тривалість (доба) стадій розвитку проростків Y.torreyi
in vivo та in vitro
Клональне мікророзмноження юкк in vitro є перспективним методом розмноження поряд з традиційним насінним. Нами були визначені три шляхи індукції утворення адвентивних бруньок з використанням модифікованих у відділі Експериментальної біології середовищ МС та QL що містять 6-БАП, ІМК і НОК (Рис. 3).
Краща закладка адвентивних бруньок (в середньому 1:8) відбувалася при послідовному культивуванні епікотилей і мікропагонів, одержаних внаслідок розвитку зіготичних зародків на живильних середовищах: QL, доповненого 2 мг/л БАП і 0.4 мг/л ІМК та QL, що містить 2 мг/л БАП і 0.4 мг/л НОК. Активний різогенез відзначали на середовищі МС з 0.1 мг/л НОК. Приживаність рослин досягала 80-95% при пікіровці регенерантів у грунт, взятий з плато Ай Петрі. (Табл. 4, 5, 6)
Таблиця 4 - Ефективність адвентивного пагоноутворення
Таблиця 5 - Індукція розвитку бруньок і утворення пагонів Y.torreyi при трьох способах клонального мікророзмноження
*Примітка: +активна, ± середня, – низька
Таблиця 6 - Основні характеристики рослин Y. torreyi, одержаних з зародків перед висадкою в умови in vivo
Як показали результати дослідів, потенційна ефективність мікророзмноження Y.torreyi через індукцію адвентивного пагоноутворення in vitro значно перевершує можливості культури in vitro ізольованих зіготичних зародків (Табл. 7).
Таблиця 7 - Порівняльна характеристика результатів мікророзмноження Y.torreyi в умовах in vitro
*- що відповідає числу насіння, одержаного при штучному запиленні 100 квіток при реальному, в умовах інтродукції, 15% - ному зав'язуванні плодів
При роботі з культурою калюсу було виявлено, що активне калюсоутворення відбувалося на середовищі МС з 0.5 мг/л БАП і 4 мг/л 2.4-Д (Табл. 8). Активний калюсогенез спостерігали з зіготичних зародків, середній - з висічок листка, слабкий - з висічок коріння. Калюс зародкового походження володів високим морфогенетичним потенціалом, що реалізується через гемогенез, різогенез та ембріоідогенез. Аналогічні типи морфогенезу відзначені в калюсі листкового походження, проте здатність їх до морфогенезу була нижча. Низький морфогенетичний потенціал відзначали у калюсів кореневого походження.
Таблиця 8 - Індукція калюсоутворення на модифікованому середовищі МС, що містить 0.5 мг/л БАП і 4мг/л 2.4-Д
* - Висічки листків бралися з базальної зони листка
Первинний калюс без ознак гістогенезу і морфогенезу не містив СГ. Синтез СГ пов'язаний з початком гістогенезу і осередки синтезу знаходились поблизу провідних елементів, що диференціюються. При цьому самі провідні елементи не містили сапоніни.
РОЗДІЛ 5. Визначення стероїдних глікозидів в
Органах і тканинах Yucca torreyi Shafer.
При вивченні здатності інтактних рослин синтезувати СГ були досліджені листя, коріння, квітки і насіння.
Результати гістохімічного аналізу СГ в листках рослин Y. torreyi, що вступили в репродуктивну фазу були ідентичні для рослин, здатних і не здатних зав'язувати насіння і показали різну локалізацію олігоспіростанозидів і олігофуростанозидів в тканинах листя. Провідні елементи ксилеми і механічні пучки реакції на сапоніни не давали. Цікаво те, що спостерігалася певна симетрія в положенні клітин-вмістилищ олігофуростанозидів відносно продихового апарату в епідермісі листка.
Аналіз СГ в листках рослин різного віку, що ростуть в умовах in vivo та in vitro виявив залежність накопичення СГ від віку рослин і зони листка. Вміст СГ був вищий в базальній частині листя однорічних рослин, що ростуть in vivo в порівнянні з рослинами, що ростуть in vitro.
Порівняльний ТШХ-аналіз олігоспіростанозидів і олігофуростанозидів рослин, що вступили в репродуктивну фазу, здатних і не здатних зав'язувати повноцінне насіння показав відмінності в хроматографічній рухливості і в числі СГ. При цьому, загальне число виявлених СГ в листках рослин, здатних зав'язувати насіння, становило 36 (23 ССГ і 13 ФСГ), а в листі рослин, не здатних зав'язувати насіння - 34 (24 ССГ і 10 ФСГ).
Визначення СГ в корінні рослин, що вступили в репродуктивну фазу, було утрудено із-за присутності в різодермі густого темно-червоного пігменту, що перешкоджає хроматографуванню. Проте, в них містилося не менше чотирьох СГ. Як показали дані гістохімічного аналізу, вміст ССГ і ФСГ в корінні залежав від віку рослини. Причому, останні були локалізовані переважно в ЦОЦ і значно в менших кількостях в клітинах первинної кори. СГ також виявлялися в корінні рослин, що ростуть in vitro, але були відсутні в культурах коріння, індукованих з ізольованих зіготичних зародків.
В результаті визначення місця первинного синтезу СГ встановлено, що олігоспіростанозиди і олігофуростанозиди присутні в пагонах і в корінні рослин що ростуть in vitro. В культурі адвентивних пагонів відзначали позитивну реакцію виключно на олігофуростанозиди. Проте в культурі коріння СГ не виявлені. В індукованих з калюсу корінні і ембріоїдах, що знаходяться на ранніх стадіях розвитку, СГ були відсутні. Поряд з цим, в регенерованих з калюсу бруньках виявлені олігофуростанозиди (Табл. 9). На основі цього ми можемо затверджувати, що в рослинах Y. torreyi місцем синтезу СГ є пагони.
Таблиця 9 - Присутність стероїдних глікозидів in vitro в морфогенних структурах
Квітки, що знаходилися на різних стадіях фізіологічної зрілості дуже відрізнялися за складом СГ, причому, найбільшу різноманітність спостерігали в квітках V порядку. В квітках III порядку, що знаходилися на стадії пухкого пуп'янка і є найбільш готовими до запилення були присутні 6 СГ. При ТШХ-аналізі квіток відповідних порядків, рослин, здатних і не здатних зав'язувати насіння, відмінності в складі СГ виявлені не були. При хроматографуванні витяжок з частин квіток, рослин здатних і не здатних до зав'язування насіння, виявлено, що кількість СГ у відповідних частинах була ідентична. Хроматографічна рухомість у випадку з частинами, що відповідають за виконання репродуктивної функції, відрізнялась, а у випадку з частинами, безпосередньо не пов'язаними з репродуктивною функцією, була ідентична. Всього за даними ТШХ, з квіток різного порядку виділені не менше 28 індивідуальних сполучень.
В результаті гістохімічної реакції з реактивом Лафона СГ були виявлені як в периспермі, так і в зародку насіння. ТШХ показала наявність в насінні 9 СГ - 2 ФСГ і 7 ССГ з переважанням першого і третього.
Специфічні реакції з реактивом Ерліха і Саньє свідчать про наявність олігофуростанозидів в зародку при їхній практично повній відсутності в переспермі. Це підтверджується ТШХ, що показала присутність в зародку двох олігоспіростанозидів і двох олігофуростанозидів з перевагою останніх. В той же час в периспермі переважали олігоспіростанозиди, про що свідчать дані гістохімічного і ТШХ аналізів.
СГ насіння складали 20% від їхньої маси і були представлені переважно похідними двох генінів, з переважанням більш полярного, який був виділений в чистому вигляді з 10%-вим виходом від маси насіння. Він виявився близьким за хроматографічною рухомістю до тигогеніну і смілагеніну і більш полярним щодо гекогеніну.
Аналіз структури з залученням ЯМР- і 13С- спектроскопії, показав, що даний глікозид є 3-о-β-D-глюкопіранозил-(1→2)-о-β-D-галактопірано-зидом сарсапогеніна. (Табл. 10, Рис. 4)
1H-ЯМР спектр 1(δ, м.д., О-ТМС, С5D5N): 5:34 (д, J1,2=7,8Гц, Н-1 Gal), 4,98 (д, J1,2=7,5Гц, H-1 Glc), 3,45 (дд, J26a,26b=10,5 Гц, J26a,25e=2,5Гц, Н-26а), 1,24 (д, J27,25=63Гц, 27-СН3), 1,16 (д, J21,20=6,6Гц, 21-CH3), 1,04 (c, 19-CH3), 0,91 (c, 18-CH3).
Табл.10 - Хімічні зрушення сигналів атомів 13С глюкозида 1,
(δ, м.д., О-ТМС, C5D5N)
| 
