|
КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА
Матвієнко Наталія Миколаївна
УДК 578.825.1. 578.831.1
БІОЛОГІЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ТА ІНДИКАЦІЯ ВІРУСУ
ІНФЕКЦІЙНОЇ АНЕМІЇ КОНЕЙ
03.00.06. – вірусологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ-2002
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в лабораторії вірусології Інституту
ветеринарної медицини Української академії аграрних наук
Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, Старчеус
Анатолій Павлович, Інститут ветеринарної медицини
Української академії аграрних наук, завідувач лабораторією вірусології
Офiцiйнi опоненти: доктор біологічних наук, професор
Бучацький Леонід Петрович, провідний науковий співробітник
Київського національного університету імені Тараса Шевченка
кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник
Дерябіна Олена Григорівна, провідний науковий співробітник
сектору гібридомних технологій та генної інженерії
Інституту ветеринарної медицини
Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб
ім. Л.В. Громашевського АМН України
Захист дисертації відбудеться "_11___" _червня __ 2002 року.
о_14_годинi на засіданні спеціалізованої вченої ради
Д 26.001.14 Київського національного університету імені Тараса
Шевченка за адресою:
03127, Київ, проспект Глушкова, 2, корп. 12, ауд. 215
Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського
національного університету імені Тараса Шевченка :
01033, Київ-33, вул. Володимирська, 58.
Автореферат розісланий "__7__" __травня __ 2002 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Молчанець О.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Важливе місце серед питань сучасної вірусології посідають повільні інфекції людини та тварин. Ця проблема викликає особливий інтерес через те, що в основі розвитку повільної інфекції покладені порушення генетичних, імунологічних і фізіологічних механізмів, які забезпечують довготривалу персистенцію вірусу в організмі та різноманіття форм інфекційного процесу. Разом з тим, вивчення повільних інфекцій дасть змогу зрозуміти молекулярний механізм, що визначає уповільнений характер патологічного процесу. Здатність вірусу до підтримання різних форм персистенції є важливим екологічним механізмом, що сприяє збереженню збудника як виду. Отже, діапазон проблем, що спричиняються персистенцією вірусів, надзвичайно широкий і потребує пильної уваги та подальшого вивчення. На сьогодні серед повільних інфекцій тварин досить поширеною є інфекційна анемія коней (ІНАН). Біологічні особливості вірусу інфекційної анемії коней, а зокрема суттєві труднощі при культивуванні в умовах in vitro, нечутливість лабораторних тварин до вірусу значно утруднює вивчення циклів розмноження, динаміку накопичення вірусу, вивчення локалізації в органах і тканинах ураженого організму. Не маючи задовільного методу титрування вірусу інфекційної анемії, надзвичайно важко розробити і контролювати технологічні параметри отримання вірусної сировини. На сьогоднішній день в Україні не існує жодного методу індикації антигену в культуральній системі, що надзвичайно важливо для виробництва діагностичних препаратів.
Не дивлячись на те, що за останні роки досягнуто певних успіхів у вивченні хвороб коней та вдосконалення заходів боротьби з ними, є ще багато не вирішених питань. Не повністю вивчене поширення захворювання на інфекційну анемію коней в Україні, не розроблені підходи до прогнозування та профілактики.
Лабораторна діагностика з використанням загальноприйнятих серологічних методів не дає очікуваних результатів. Не проводиться експрес-діагностика для виявлення антигену вірусу ІНАН. Своєчасне виявлення вірусу серед поголів’я коней, дозволить суттєво зменшити втрати та зберегти кошти, а для цього необхідна досконала лабораторна діагностика. За даними канадських та американських фахівців, які займаються вивченням цього захворювання [Sugiura T., Matsumura T., Fukunaga М., 1986 та Neurath A., Strick N., 1990], найбільш чутливими, швидкими та специфічними методами діагностики є реакція імунофлуоресценції (РІФ) та полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР). Але придбання діагностичних наборів для їх виконання нашими спеціалізованими лабораторіями практично не можливе, оскільки їх ціна досить висока. Отже, в сучасних умовах для ефективної діагностики та профілактики інфекційної анемії коней в Україні нагальною потребою є створення та виробництво вітчизняного набору для виявлення антигену вірусу ІНАН в реакції імунофлуоресценції, який би задовольнив більшість лабораторій, що займаються такими дослідженнями. Це зумовило вибір теми роботи.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в плані державного завдання Інституту ветеринарної медицини УААН згідно з тематикою “ Розробити ефективну систему діагностики, терапії і профілактики інфекційних хвороб коней” з 1.01.1996 року до 30.12.2000 року
№ 01297u012747 та № 79/1 “Розробити засоби і методи діагностики інфекційної анемії коней” від 04.01.2001 року, № 0101u002655.
Мета і завдання досліджень. Метою роботи було вивчення біологічних властивостей вірусу, особливостей інфекційного процесу при ІНАН коней, розробка і впровадження методів для діагностики захворювання на ранніх етапах, виявлення локалізації вірусу ІНАН в органах та тканинах коней за допомогою реакції імунофлуоресценції, а також проведення порівняльної оцінки методу з існуючими лабораторними тестами.
Для досягнення поставленої мети потрібно було вирішити такі завдання:
вивчити цикл репродукції вірусу ІНАН в чутливих біологічних системах та дати морфологічну характеристику вірусу;
дослідити особливості культивування вірусу інфекційної анемії коней;
змоделювати інфекцію на природно чутливих тваринах та провести гістологічну оцінку ураження організму під дією вірусу;
визначити біохімічні зміни в крові хворих коней;
розробити тест-систему для індикації вірусу інфекційної анемії коней методом флуоресціюючих антитіл;
порівняти діагностичну ефективність методу флуоресціюючих антитіл з існуючими лабораторними тестами (РДП, РЗК, ІФА).
Об’єкт дослідження – вірус інфекційної анемії коней.
Предмет дослідження – біологічні властивості вірусу інфекційної анемії коней.
Методи досліджень – включали метод біологічного тестування з використанням культури клітин та чутливих тварин, клінічні (хворі на інфекційну анемію коні), визначення гематологічних та біохімічних показників крові хворих тварин, вірусологічні та серологічні (індикація антигену вірусу інфекційної анемії коней).
Наукова новизна роботи. Проведено виділення в Україні місцевих ізолятів вірусу ІНАН, вивчені фізико-хімічні та деякі біологічні властивості цих ізолятів. Зроблена їх порівняльна оцінка з референтними штамами вірусу ІНАН. Отримані результати дають можливість підібрати штами для виробництва діагностичних та вакцинних препаратів. Одержано нові практичні дані щодо вивчення таких теоретичних питань, як латенція та персистенція при ІНАН коней та інших повільних інфекціях родини Retroviridae.
Вперше був розроблений і запропонований для впровадження в повсякденну практику метод індикації антигену вірусу інфекційної анемії коней за допомогою РІФ, впровадження якого в практику лабораторій ветеринарної медицини дозволить значно підвищити рівень обстеження коней та проводити серологічну діагностику інфекційної анемії коней в Україні.
Запропонована модифікована реакція імунофлуоресценції є високочутливою, специфічною та придатною для проведення масових досліджень на інфекційну анемію коней.
Практичне значення одержаних результатів. Розроблений метод індикації антигену вірусу інфекційної анемії коней з одного боку розширює набір методів діагностики при цій хворобі, а з іншого боку дає можливість швидко ідентифікувати вірус ІНАН, який циркулює на цей час серед поголів’я досліджуваних коней. Вивчені імунобіологічні властивості будуть корисними при виробництві препаратів для діагностики та профілактики ІНАН.
На запропонований метод складена нормативно-технічна документація, яка після її затвердження, дозволить налагодити виробництво діагностичних наборів.
Методика постановки реакції викладена у “Методиці постановки реакції для індикації антигену вірусу ІНАН”, яка розглянута Методичною комісією та затверджена Вченою радою ІВМ УААН від 14 грудня 2001 року. Запропоновано використовувати цей метод в наукових та практичних дослідженнях.
Отримані наукові дані можуть бути використані в навчальних курсах університетів з вивчення біологічних властивостей вірусів тварин.
Особистий внесок здобувача. Інформаційний пошук, опрацювання літературних даних, розробка схеми експериментів, отримання експериментальних даних, їх узагальнення та інтерпретація автором здійснені особисто. Результати дослідження з отримання компонентів для РІФ здійснені спільно з науковими співробітниками лабораторії біотехнології Інституту гематології та трансфузіології АМН України, гістологічні дослідження здійснені з участю наукових співробітників кафедри патологічної анатомії Національного аграрного університету.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались та апробовані на:
засіданнях Вченої ради ІВМ УААН 1997-2001 рр.(з розгляду матеріалів річних звітів і за результатами аспірантури);
науково-практичній конференції “Зооантропонозні хвороби, засоби профілактики і боротьби” (23-24 жовтня 1997 р., м. Гродно);
ІІ Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси” (7-10 вересня, 1998 р., м. Київ);
Конференції молодих вчених, м. Суми (1998 р.);
ІІ (ІХ) з’їзді українського мікробіологічного товариства (2000 р, м. Чернігів);
Всеукраїнській конференція молодих вчених “Проблеми патології тварин та шляхи їх вирішення” (11 жовтня 2000 р., м. Київ);
ІІІ Міжнародному Симпозіумі “Україна-Австрія. Сільське господарство: наука і практика” ( 14-16 вересня 2000 р., м. Чернівці);
Проведені міжлабораторні комісійні випробування ”Метод індикації антигену вірусу інфекційної анемії коней методом флуоресціюючих антитіл”, які оформлені відповідними документами.
Публікації. Основні положення роботи викладені в 6 статтях, із них 4 надруковані у фахових виданнях.
Структура і обсяг роботи. Матеріали дисертаційної роботи викладені на 140 сторінках машинописного тексту і містять вступ, огляд літератури, матеріали і методи досліджень, експериментальну частину, результати роботи та їх обговорення, висновки, список використаних джерел та додатки. Список літератури охоплює 211 найменувань, із них 145 - іноземні.
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Огляд літератури складається з розділів, в яких наведені дані останніх років стосовно вивчення біологічних властивостей вірусу інфекційної анемії коней. Висвітлені питання розповсюдження захворювання серед поголів’я коней у світі та на Україні. Обговорюються питання лабораторної діагностики інфекційної анемії коней.
МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об’єктом дослідження були референтні штами вірусу інфекційної анемії коней: EIA P 337 V 26 13, надісланий з Японії, і Wyoming W 40, надісланий з США, та ізоляти вірусу виділені від коней із господарств Черкаської – З 14261/97, Ч 17714/01 та Сумської – С 14378/98 областей та адаптовані до культури лейкоцитів коня.
Робота проводилась на базі Інституту ветеринарної медицини УААН в лабораторії вірусології, в лабораторії біотехнології Інституту гематології та трансфузіології АМН України, в лабораторії гістології кафедри патологічної анатомії Національного аграрного університету.
При вивченні фізико-хімічних властивостей вірусу досліджували вплив хлороформу, зміни рН, підвищеної температури та іонів магнію на інфекційну активність. У випадку чутливості вірусу до хлороформу спостерігали відсутність цитопатичної дії (ЦПД) вірусу, обробленого хлороформом, при наявності ЦПД у флаконах, де знаходився не оброблений хлороформом вірус. Готували буферні розчини з рН від 4,0 до 9,0. Про ступінь впливу рН на інфекційну активність вірусу робили висновок за різницею в титрах інфекційності вірусу до та після обробки. Про дестабілізуючу дію іонів магнію судили із зниження чи відсутності зниження інфекційності вірусу при прогріванні в присутності MgCl2 в порівнянні з титром вірусу, прогрітого без нього.
Для дослідження морфології віріонів використовували метод негативного контрастування. Препарати досліджували в електронному мікроскопі TESLA (виробництва Чехії) при експериментальному збільшенні 50000.
Культивування вірусу інфекційної анемії коней в культурі лейкоцитів коня та нирки ембріону коня здійснювали за модифікованими нами методиками.
До суспензії лейкоцитів додавали фітогемаглютінін (ФГА)-PHITOHДMAGGLUTININ M, фірми “Seromed®”, Німеччина. Для культивування використовували пеніцилінові флакони та чашки Кареля. Культуру вирощували в атмосфері, що містила 2% вуглекислого газу.
Для отримання первинно-трипсинізованих та субкультур використовували нирки ембріонів коня віком 7-10 місяців. Одержання культури проводили за методом дезагрегації тканини при обробці трипсином згідно рекомендацій Р.В. Білоусова. Культивування проводили в матрасах об’ємом 50 та 100 см3. Життєздатність клітин визначали за допомогою фарбування 0,4%-ним розчином три панового синього. За зміною морфології клітин спостерігали при щоденному прогляданні флаконів під світловим мікроскопом, використовуючи збільшення × 8, × 40.
Для гістологічного дослідження відбирали шматочки від уражених тварин з печінки, селезінки, серця, лімфатичних вузлів та нирок. Відібрані шматочки поміщали у 10% нейтральний розчин формаліну. Фіксували впродовж місяця. Гістологічні препарати готували за методикою Потоцького М.К., виготовлення гістологічних зрізів проводили на санному мікротомі та наклеювали їх на предметні скельця. Фарбували гістологічні зрізи гематоксиліном Караці та еозином. Для гістохімічного виявлення заліза препарати фарбували за Перлсом. Зміни виявляли, проглядаючи препарати під світловим мікроскопом. Пігменти, що містили залізо, забарвлювались в блакитний колір (берлінська лазур), ядра - в червоний.
Гематологічні дослідження проводили за стандартними методиками з використанням камери Горяєва та гемометра Салі (Кондрахін І.П., 1985).
При вивченні біохімічних показників крові вміст загального білка визначали на рефрактометрі за рефракцією сироватки крові, тобто за визначенням коефіцієнту заломлення пучка променя в сироватці крові коней. Визначення білкових фракцій в сироватці крові проводили нефелометричним методом.
Визначення антитіл до вірусу інфекційної анемії коней в сироватках крові коней проводили за допомогою реакції дифузної преципітації (РДП) з використанням набору “Антиген и антисыворотка для диагностики инфекционной анемии лошадей в РДП” Щолківського біокомбінату ТУ 46-21-379-77.
На підставі одержаних даних були сформовані дослідні та контрольні групи.
Постановку реакції імунофлуоресценції здійснювали за модифікованою нами методикою.
Виділення імуноглобулінів із сироваток крові та отримання ФІТЦ-кон’югату проводили за методиками, розробленими та вдосконаленими в лабораторії біотехнології Інституту гематології та трансфузіології АМН України. Використовували флуоресцеїнізотіоціанат ( ФІТЦ) – FITC- FW 3894, F –3651, lot 79H 5070, виробник фірма “Sigma”. Після закінчення процесу кон’югації в реакційній суміші могли міститись залишки ФІТЦ, органічні розчинники та солі буферних розчинів. Ці залишки є однією з причин неспецифічного світіння при фарбуванні досліджуваних препаратів. Для очищення кон’югату використовували колонку з сефадексом різних дисперсних форм (G 50, G 25). Були підібрані оптимальні умови проходження кон’югату через колонку, що дозволило скоротити втрати білка до мінімуму.
Повноту очистки препарату визначали методом висхідної хроматографії на папері (Перадзе Т.В., 1985).
Для підтвердження специфічності ФІТЦ-кон’югату визначали вміст білка, співвідношення барвника та білка та досліджували його в реакції імунофлуоресценції.
Статистичні методи обробки результатів дослідження - варіаційний та кореляційний аналізи (Сепетлієв Д.,1968, Колемаєв В.,1991).
Матеріал документували мікрофотографіями.
РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Аналіз захворювання коней на інфекційну анемію в Україні
В Україні захворювання коней на інфекційну анемію реєструється в 10 областях. Найбільший відсоток ураження поголів'я відмічено в північних Поліських областях, зокрема в Волинській, Житомирській, Рівненській та Черкаській. Загалом по Україні в 1998 році на 11934 обстежених коней зафіксовано 1,40 % хворих тварин, в 1999 на 7866 обстежених – 0,70 %, а в 2000 на 8693 обстежених – 0,64 %, що свідчить про низький рівень діагностичних та профілактичних заходів ( Рис.1).
Рис.1. Захворювання коней на інфекційну анемію в Україні з 1993 по 2000 роки (за даними Департаменту ветеринарної медицини Міністерства аграрної політики)
Поголів’я коней в Україні з 1993 року до 2000 року зросло з 750 тис. до 900 тис. тварин, а об’єм серологічних досліджень зменшився з 2,04% до 0,96%. Така ситуація сприяє стійкому збереженню вогнищ вірусу ІНАН ( Рис. 2)
Рис. 2. Динаміка діагностичних досліджень коней на ІНАН в Україні
При аналізі наведених даних відмічається стійка тенденція до зменшення кількості діагностичних досліджень. Перш за все, це пов’язано з тим, що для проведення діагностичних досліджень використовується лише РДП, а в Україні виробництво цих діагностикумів відсутнє. Значна кількість коней зосереджена в приватних та фермерських господарствах, які через брак коштів не можуть придбати діагностикуми для обстеження коней на вірусні інфекції.
Таким чином, надзвичайно низький рівень обстеження наявного поголів’я коней не дає можливості об’єктивно оцінити ситуацію щодо розповсюдження захворювання на ІНАН. При аналізі ситуації в окремих господарствах відмічено, що хвороба, з’явившись, згодом реєструється постійно, що сприяє стійкому збереженню вогнищ та широкому розповсюдженню вірусу серед наявного поголів’я коней.
2. Репродукція вірусу інфекційної анемії коней в чутливих культурах клітин
З метою вивчення чутливості вірусу та підбору оптимальних умов культивування використовували культуру лейкоцитів коня та первинно-трипсинізовану культуру нирки ембріону коня.
Вірус, адаптований до первинно-трипсинізованої культури нирки ембріону коня, культивували впродовж 54 днів. Розмноження та накопичення вірусу в культурі проходило без видимих морфологічних змін, тому індикація вірусу проводилась з використанням РІФ. Експериментально підтверджено, що РІФ є високочутливим методом для виявлення вірусу в цій системі. Максимальна концентрація вірусу відмічена на 5-7 пасажі, що відповідає 25-35 добі культивування. Отримані дані дозволяють використовувати цю культуру клітин для індикації, накопичення та вивчення біологічних властивостей вірусу ІНАН.
Для адаптації вірусу до культури лейкоцитів коня було проведено 7 сліпих пасажів строком культивування до 7-10 діб.
З метою встановлення можливої цитопатичної дії вірусу на культуру, проводили щоденні спостереження під малим збільшенням світлового мікроскопу, порівнюючи заражені культури з контролями. При цьому звертали увагу на морфологію клітин, строки прикріплення і відшарування їх від скла, тривалість життя та інші зміни.
Гіпертрофія клітин відмічалась протягом 2-10 діб культивування: клітини втрачали округлу форму, у частини із них з’являлись виступи цитоплазми (псевдо події). На 5 добу культивування відбувалось незначне розрідження моношару клітин, деякі з них зморщувались і відшаровувались від скла, інші лишались на склі, але були нежиттєздатними. До кінця строку культивування (10 доба) 50% клітин, що прикріпились до скла, були нежиттєздатні. Результати експерименту наведені у таблиці 1
| 
