|
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО
КОБЗИСТА ОКСАНА ПЕТРІВНА
УДК 582.288—11+577.18
АНТИБІОТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ МІКОТОКСИНІВ ТА ДЕЯКІ НАПРЯМКИ ЇХ ПРАКТИЧНОГО ВИКОРИСТАННЯ
03.00.07 - мікробіологія
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
КИЇВ – 2002
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.
Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Зайченко Олександр Максимович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, керівник лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів
Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів
доктор біологічних наук Бухало Ася Сергіївна, Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, головний науковий співробітник відділу мікології
Провідна установа: Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра мікробіології і загальної імунології, Кабінету Міністрів України
Захист відбудеться “20” листопада 2002 р. о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 по захисту докторських дисертацій при Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного,154.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного,154.
Автореферат дисертації розіслано “ 17 ” жовтня 2002 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради,
кандидат біологічних наук,
старший науковий співробітник Пуріш Л.М.
Актуальність проблеми. На сьогодні відомо біля 200 видів токсиноутворюючих грибів та понад 400 різних мікотоксинів, які суттєво відмінні за хімічною будовою та біологічними властивостями.
Не зважаючи на велике різноманіття структур та шкодочинність існуючих мікотоксинів, лише деякі з них регламентовані в продуктах, кормах та продовольчій сировині на законодавчому рівні. Це стосується зокрема афлатоксинів (0,005 мг/кг), Т-2 токсину (0,1 мг/кг), дезоксиніваленолу (0,5 мг/кг), патуліну (0,05 мг/кг) та зеараленону (1 мг/кг). В той же час відомо, що регламентовані рівні часом суттєво перевищують концентрації мікотоксинів, здатних справляти антибіотичну, імунодепресивну та фітотоксичну дію [Тутельян, Кравченко, 1985, Abraham, Florey, 1949, Зайченко и др., 2001].
З огляду на це, слід вирішити питання щодо можливого впливу допорогових концентрацій мікотоксинів на резидентну мікрофлору людини та тварин, наслідком якого можуть бути дисбактеріози, та на імунний статус організмів, що призводить до зниження їх резистентності. Не передбачуваним лишається і вплив мікотоксинів на мікрофлору патогенних мікроорганізмів при різних хворобливих станах.
З іншого боку, колонізація сільськогосподарських рослин токсиноутворюючими мікроміцетами може вносити корективи в характер взаємовідносин “рослина – хазяїн — фітопатоген”. Спеціальних досліджень цієї проблеми досі не проводилось, що робить постановку таких завдань вкрай актуальною.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ в рамках проведення досліджень за темою 2.28.9.7. (проблема — “мікробіологія”) “Вивчити особливості вторинного метаболізму Dendrodochium toxicum та інших грибів-продуцентів макроциклічних трихотеценів”; проекту Державної науково-технічної програми “Біотехнологія” Державного комітету України з питань науки, техніки та промислової політики “Пошук нових фізіологічно активних сполук з мікроскопічних грибів з метою їх подальшого використання в сільському господарстві, медицині та для аналітичних робіт” (реєстраційний № 08.04.04/002к - 95) та теми 2.28.9.7. “Провести порівняльне дослідження компонентного складу та біологічної активності макроциклічних трихотеценів Dendrodochium toxicum Pidopl. et Bilai”.
Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було дослідження антибіотичних властивостей регламентованих (афлатоксин В1, Т-2 токсин, дезоксиніваленол, зеараленон, патулін) та деяких інших (веррукарин А, рорідини А і Н) мікотоксинів щодо мікроорганізмів різних систематичних груп: дріжджів, фітопатогенних бактерій, спороутворюючих Грам+ коків, водоростей.
Досягнення поставленої мети передбачало вирішення ряду завдань:
— напрацювання препаративних кількостей деяких мікотоксинів (афлатоксин В1, рорідин Н, дезоксиніваленол);
— дослідження власне антибіотичних властивостей мікотоксинів;
При цьому ставилось завдання акцентувати увагу на характері взаємовідносин “мікотоксин — резидентна мікрофлора”, “мікотоксин — фітопатоген”.
У роботі було проведено ряд досліджень, постановка яких була продиктована в процесі виконання поставлених завдань. Зокрема, це стосується удосконалення методу виділення дезоксиніваленолу, дослідження можливості мікробіологічної інактивації Т-2 токсину, розробки мікробіологічного методу індикації мікотоксинів в зерні і зернопродуктах.
Об'єктом дослідження були регламентовані (афлатоксин В1, Т-2 токсин, дезоксиніваленол, зеараленон, патулін) та деякі інші (веррукарин А, рорідини А і Н) мікотоксини щодо різних систематичних груп: дріжджів, фітопатогенних бактерій, спороутворюючих Грам+ коків, водоростей.
Предметом дослідження були антибіотичні властивості мікотоксинів, а саме фунгістатична активність трихотеценових мікотоксинів та їх антибактеріальні властивості.
Матеріали та методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використовували мікробіологічні, фізіологічні, фізико-хімічні методи дослідження.
Наукова новизна одержаних результатів.
— Удосконалено метод виділення дезоксиніваленолу. Застосування для екстракції системи ацетонітрил - вода (3:1) забезпечує найбільш повне вилучення токсину і гарантує безпечність продуктів харчування та кормів, які аналізуються.
— Вперше відібрано штами дріжджів, здатні метаболізувати Т-2 токсин з утворенням менш токсичних сполук.
— Експериментально підтверджена можливість інактивації Т-2 токсину за допомогою таких штамів дріжджів, що відкриває перспективу розробки способу знезараження кормів для тварин.
— Вперше досліджені антибіотичні властивості мікотоксинів щодо ряду фітопатогенних бактерій, Грам+ спороутворюючих коків та зелених водоростей.
— Створено банк чутливих та стійких мікроорганізмів, як об'єктів для розробки методів індикації та інактивації мікотоксинів.
— Показана принципова можливість використання чутливості дріжджів до мікотоксинів, як додаткового критерію при їх видовій диференціації.
Практичне значення одержаних результатів. На основі одержаних даних запропоновано мікробіологічний експрес-метод індикації мікотоксинів в зерні і зернопродуктах, який суттєво знижує фінансові і часові затрати, зменшує шкідливий вплив на довкілля і економить матеріальні та енергетичні ресурси. Метод переданий для виробничого випробування в Київську міську санітарно-епідеміологічну станцію та Одеський державний Центр стандартизації, метрології і сертифікації.
Удосконалено метод виділення дезоксиніваленолу, що суттєво підвищує надійність одержаних результатів і створює умови безпечного санітарно-токсикологічного контролю продуктів харчування та кормів для тварин.
Особистий внесок здобувача. Основна частина експериментального матеріалу, викладеного в дисертації, отримана автором самостійно. Особиста участь дисертанта полягала в розробці методичних підходів щодо виконання поставлених завдань, експериментальному їх обгрунтуванні, критичному аналізі даних літератури, узагальненні одержаних результатів, статистичній обробці цифрового матеріалу, розробці мікробіологічного методу аналізу мікотоксинів в зерні і зернопродуктах.
Постановка завдань та обговорення одержаних результатів проводились спільно з науковим керівником. Друковані роботи підготовлено при безпосередній участі автора спільно з науковим керівником.
Апробація результатів дисертації. Результати дисертаційної роботи були представлені на Міжнародній науково-практичній школі для молодих вчених і спеціалістів “Природні екосистеми Карпат в умовах посиленого антропогенного впливу” (Ужгород, 4-7 жовтня 2001 р.), на Першому з'їзді мікологів Росії (Москва, 11-13 квітня 2002 р.), на Всеукраїнській конференції молодих вчених (Київ, 28-30 жовтня 2002 р.). Вони доповідались також на конференції молодих вчених Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (Київ, 11-12 грудня 2000 р.) та на конференції молодих вчених, присвяченій 135-річчю з дня народження акад. Д.К. Заболотного (Київ, 3-4 грудня 2001 р.).
Публікації. Результати дисертаційної роботи представлені в 3 статтях, опублікованих в профільних журналах та в 2 тезах, опублікованих за матеріалами з'їздів та конференцій.
Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 140 сторінках машинописного тексту і складається з розділів “Вступ”, “Огляд літератури”, “Матеріали і методи досліджень”, “Результати досліджень”, “Заключення”, “Висновки”, “Список літератури”, який містить 206 посилань (з яких 184 іноземних авторів). Робота містить 16 таблиць та 21 рисунок.
РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
Огляд літератури представлений 4 підрозділами, в яких розглядаються питання історії відкриття продуцентів та їх поширення, хімічної природи та біологічної активності регламентованих в харчових продуктах і продовольчій сировині мікотоксинів: афлатоксини, патулін, зеараленон, Т-2 токсин та дезоксиніваленол (вомітоксин).
РОЗДІЛ 2. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ
Об'єктами досліджень були 506 штамів дріжджів, що віднесені до 24 видів і 10 родів. Культури дріжджів були виділені з ризосфери і філосфери сільськогосподарських і дикоростучих рослин, водойм, холоднокровних та теплокровних організмів. У наше розпорядження вони були надані з музею культур відділу фізіології промислових мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології НАНУ ст.н.сп. С.С. Нагорною, а також 80 штамів фітопатогенних бактерій (3 роди і 36 видів), виділених з овочевих та плодових культур, кормових трав, злаків, бобів, квіткових та деяких технічних культур, які були одержані з музею культур відділу фітопатогенних бактерій Інституту мікробіології і вірусології НАНУ від пров. інженера Н.В. Житкевич. Досліджувалось також 47 штамів Грам+ спороутворюючих коків (4-х видів), виділених від урологічно хворих людей (33 штами) та від здорових телят (14 штамів), які були надані в наше розпорядження з музею культур відділу антибіотиків Інституту мікробіології і вірусології НАНУ пров.н.сп. І.Б. Сорокуловою, за що ми їм щиро вдячні.
Об'єктом дослідження були також 16 штамів зелених водоростей, серед них 7 хлорофільних мутантів, що належать до двох видів роду Chlorella, а саме C. vulgaris (10 штамів) та C. kessleri (6 штамів). Всі штами водоростей були люб'язно передані нам з відділу альгології Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України.
В роботі переважно були використані комерційні зразки мікотоксинів фірми „Sigma” (США), окремі з них (патулін і зеараленон) були одержані з Інституту ветеринарної медицини УААН. Деякі з мікотоксинів були виділені нами з культур-продуцентів.
Для одержання препаративних кількостей мікотоксинів використовували культури Aspergillus flavus 109801, Fusarium macroceras 108270, Dendrodochium toxicum 100115 — продуценти мікотоксинів з музею культур лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів Інституту мікробіології і вірусології НАНУ.
При мікробіологічній індикації окремих фракцій мікотоксинів та при дослідженні їх антибіотичних властивостей використовували також ряд раніше виділених індикаторних штамів мікроорганізмів, таких як Candida kefyr 899, Staphylococcus aureus 209, C. vulgaris 62, Saccharomyces cerevisiae шт. “Феодосія” та Kluyveromyces flagilis D-25.
Дослідження антибіотичних властивостей мікотоксинів щодо дріжджів, фітопатогенних бактерій, Грам+ спороутворюючих коків та водоростей здійснювали за допомогою методу дисків (“Методы...”, 1982).
У роботі використовували добові культури дріжджів, вирощених в пробірках на скошеному сусло-агарі рН 4,5 - 5,0 при температурі 25±20С. Густина інокулюму складала 0,5х106 кл/мл.
Зони пригнічення тест-мікроорганізмів враховували після інкубації чашок протягом 18 - 24 год.
Аналогічною була постановка дослідів щодо бактеріальних штамів з тією різницею, що використовували інші середовища — м'ясо-пептонний та картопляний агар.
Для культивування водоростей використовували середовище з мікроелементами (Зольникова, 1979), а тривалість культивування складала 36 год при освітленості 4000 лк.
Культивування грибів для одержання досліджуваних мікотоксинів здійснювали на стерильній пшениці чи просі (“Методы...”, 1982). Вирощені протягом 3-х тижнів культури автоклавували при 0,5 атм (20 хв), просушували в сушильній шафі при 60 - 65 0С і розмелювали з використанням лабораторного гомогенізатора до борошноподібного стану.
Виділення та очистка мікотоксинів. У ході виділення афлатоксину В1, рорідину Н та дезоксиніваленолу нами було використано ряд методичних підходів загального характеру. При цьому виходили з намагання максимально уніфікувати окремі етапи ізоляції та очистки цих мікотоксинів. Перш за все, це стосувалось знезараження, депротеїнізації та депігментації препаратів-сирців. Нижче (рис.1) приведена узагальнена схема виділення та очистки мікотоксинів.
В результаті таких методичних прийомів нами був досягнутий високий ступінь очистки препаратів перед їх колонковою хроматографією, який позбавляв в подальшому від необхідності постановки двохмірної тонкошарової хроматографії, яка розглядається в більшості методик як додатковий прийом очистки.
Поряд з цим, при аналізі комплексу мікотоксинів в зернових субстратах, передбаченого “Медико-біологічними вимогами...” (1989), використовували метод одночасного визначення 4-х мікотоксинів (афлатоксину В1, Т-2 токсину, дезоксиніваленолу та зеараленону) в одному екстракті, який був розроблений в нашій лабораторії.
Наважка зерна
Екстракція
(двічі по 15 хв)
Обезжирювання
(рідина-рідинний перерозподіл)
ацетонітрил : н-гексан, 3:1
Осадження білкових речовин
(10 % розчин оцтовокислого свинцю)
Депігментація
(Na2SO4, безводний)
Упарювання
Колонкова хроматографія
Рис.1. Узагальнена схема виділення та очистки мікотоксинів
Фізико-хімічні методи аналізу. Для очистки та фракціонування комплексних препаратів мікотоксинів використовували метод колонкової хроматографії. За тверду фазу використовували силікагель марки “L” (“Lachema”, Brno, Чехія) ІІ ступеню активності за Брокманом і розміром частинок 100 - 160 мкм. Фракціонування здійснювали згідно методу ступеневої елюції органічними розчинниками чи їх системами в порядку зростання полярності.
Тонкошарову хроматографію виконували на пластинках “Silufol” UV 254 та UV 365 (“Kavalier”, Чехія).
Всі досліди були виконані в 3 – 6 повторностях і дані представлені як середні показники.
Статистичну обробку результатів здійснювали за допомогою прикладного пакету Microsoft Excel 2000 та Sigma Stat 2.0.
РОЗДІЛ 3. ВИДІЛЕННЯ ДЕЯКИХ МІКОТОКСИНІВ
Проведення робіт щодо дослідження біологічних властивостей мікотоксинів вимагає наявності значних кількостей цих метаболітів. Враховуючи високу вартість мікотоксинів, виконання таких робіт не завжди може бути реальним. Інколи буває і така ситуація, коли відсутнє виробництво того чи іншого мікотоксину.
Більшість з досліджуваних мікотоксинів була в нашому розпорядженні, зокрема патулін, зеараленон, веррукарин А і рорідин А. У зв'язку з відсутністю виробництва рорідину Н виникла необхідність напрацювання його в лабораторних умовах шляхом культивування високоактивного продуцента цього мікотоксину — D. toxicum 100115 та застосовуючи добре відпрацьовану методику його виділення (Зайченко, Рубежняк, 1999). В рівній мірі це стосувалось і афлатоксину В1. Що ж до дезоксиніваленолу, то в нашому розпорядженні був лише активний продуцент цього мікотоксину — F. macroceras 108270.
На рис. 2 представлені основні результати щодо виділення та очистки цих мікотоксинів, а також послідовності систем елюції для кожного з них, об'єми фракцій, що збирались, характерні профілі елюції та криві біологічної активності фракцій щодо мікробіологічних тест-культур. Вихід фракцій та їх активність поряд з цим контролювали за допомогою тонкошарової хроматографії із використанням для візуалізації плям специфічного барвника 4п-(нітробензил)піридину.
Завдяки такому підходу нам вдалось одержати в кристалічному вигляді препаративні кількості афлатоксину В1 (176,3 мг) та рорідину Н (173 мг), що забезпечило подальше виконання поставлених завдань.
Проведений аналіз даних літератури стосовно методів ізоляції і аналізу дезоксиніваленолу і, зокрема, стандартизованих методів (“Методические указания...”, 1990; “Оценка загрязнения пищевых продуктов микотоксинами”, 1985) засвідчив значні розбіжності підходів різних авторів щодо екстракції цього метаболіту. Відповідно, одержані різними дослідниками результати були не однозначними. З огляду на це, нами було проведене попереднє дослідження різних методів екстракції дезоксиніваленолу з метою порівняти і встановити, який з них є коректним і придатним для виділення токсину в лабораторних умовах.
Серед 10 досліджених нами екстрагентів були системи, пропоновані рядом “Методичних вказівок...”, як, наприклад, ацетонітрил : вода (9 : 1) та (5 : 1) і метанол : вода (9 : 1). Поряд з цим, ми досліджували більш полярні системи: метанол, метанол : вода (5 : 1) і (3 : 1) та ацетонітрил : вода (3 : 1) і (3 : 2), а також менш полярні, такі як хлороформ.
Одержані дані (рис.3) демонструють, що найбільш повна екстракція дезоксиніваленолу забезпечується при використанні системи ацетонітрил : вода (3 : 1). Якщо кількість дезоксиніваленолу, екстраговану метанолом, прийняти за 100%, то ефективність екстракції метаболіту за допомогою цієї системи складає 386%. Досить високий рівень екстракції дезоксиніваленолу забезпечується в системах ацетонітрил : вода (3:2) і (5:1) та метанол : вода (3:1). Внесені поправки в подальшому дозволили нам суттєво підвищити вихід дезоксиніваленолу і одержати його в кількості 427 мг.
Ідентичність одержаних нами препаратів мікотоксинів (афлатоксин В1, рорідин Н та дезоксинівленол) була підтверджена за допомогою загальноприйнятих тестів („Методы...”, 1982).
Таким чином, наші дані свідчать про те, що системи екстрагентів, пропоновані “Методичними вказівками...” для виділення дезоксиніваленолу, які широко використовуються в практиці випробувальних лабораторій системи Держстандарту та Міноздорову, не є коректними і дають занижені результати щодо вмісту цього метаболіту, а, відповідно, і не дають адекватної оцінки санітарно-токсикологічних показників якості продуктів харчування, кормів та продовольчої сировини при їх сертифікації.
Афлатоксин В1  Фракції: 1-5 : н-Гексан, 600 мл 6-11 : Гексан-хлороформ (9:1), 400 мл 12-15 : Гексан-хлороформ (1:1), 400 мл 16-33 : Хлороформ, 900 мл 34-37 : Хлороформ-ацетон (9:1), 200 мл 38-41 : Хлороформ-ацетон (1:1), 200 мл 42-44 : Ацетон, 400 мл Рорідин Н  Фракції: 1-10 : Гексан, 600 мл 11-13 : Гексан-хлороформ (3:1), 500 мл 14-18 : Гексан-хлороформ (1:1), 800 мл 19-20 : Гексан-хлороформ (1:2), 400 мл 21-25 : Хлорофом, 400 мл 26-27 : Хлороформ-ацетон (9:1), 300 мл Дезоксиніваленол  Фракції: 1-4 : Гексан, 800 мл 5-8 : Гексан-ефір (1:1), 600 мл 9-11 : Гексан-ефір (1:2),700 мл 12-16 : Гексан-ефір (1:4), 300 мл 17-19 : Гексан-ефір (1:7), 300 мл 20-27 : Ефір, 1200 мл 28-31 : Ефір- ацетон (1:1), 400 мл 32-48 : Ацетон, 600 мл
 Система розчинників: хлороформ-ацетон (9:1) 1-В1, 2 –В2, 3 – G1, 4 – G2  Система розчинників: толуол-діетиловий ефір (1:1) К-рорідин Н  Система розчинників: толуол-етилацетат- мурашина кислота (6:3:1)
Рис. 2. Профіль фракціонування та хроматографічний розподіл досліджуваних мікотоксинів
1 – метанол; 6 – ацетонітрил:вода (9:1);
2 – метанол:вода (9:1); 7 - ацетонітрил:вода (5:1);
3 – метанол:вода (5:1); 8 - ацетонітрил:вода (3:1);
4 – метанол: вода (3:1); 9 - ацетонітрил:вода (3:2);
5 – ацетонітрил; 10 – хлороформ.
Рис.3. Ефективність екстракції дезоксиніваленолу різними розчинниками
РОЗДІЛ 4. ДОСЛІДЖЕННЯ АНТИБІОТИЧНИХ ВЛАСТИВОСТЕЙ МІКОТОКСИНІВ
У свій час на основі відпрацьованих мікробних тестів в ІМВ НАНУ був розроблений метод індикації деяких груп мікотоксинів у різних зернових кормах (Билай с сотр., 1986). Цей метод був впроваджений у широку практику ветеринарних лабораторій Радянського Союзу і до цього часу використовується з метою профілактики мікотоксикозів сільськогосподарських тварин. Однак, цей метод має ряд недоліків: він недостатньо специфічний і розрахований на виявлення лише окремих класів мікотоксинів.
У намаганні здійснити подальший пошук високочутливих і високоспецифічних індикаторних культур і на їх основі відпрацювати метод з покращеними показниками, ми розпочинали дослідження фунгістатичних та антибактеріальних властивостей мікотоксинів.
В результаті проведених досліджень фунгістатичної активності трихотеценів нами було встановлено, що всі макроциклічні трихотецени, як і Т-2 токсин, мають широкий спектр антибіотичної дії щодо досліджуваних штамів (табл. 1). При цьому представники 6 видів (S. pombe, S. dispora, C. kefyr, R. minuta, K. dobzhanskii, K. lactis) характеризувались чутливістю до всіх досліджуваних трихотеценів. Високий відсоток чутливих штамів спостерігали серед видів родів Kluyveromyces, Debaryomyces, Trichosporon, Candida, Saccharomyces. Однак, деякі з них не проявляли чутливості до рорідину Н, або ж вона була незначною. Виняток складали досліджувані штами C. rugosa і C. kefyr, які характеризувались високою чутливістю до цього мікотоксину.
Таблиця 1
Фунгістатичні властивості деяких трихотеценових мікотоксинів
№ п/п Види Число вивчених штамів Т-2 токсин Веррукарин А Рорідин А Рорідин Н
Число чутливих штамів Діаметр стерильної зони, мм Середня МІК*, мкг Число штамів, чутливих до МІК Число чутливих штамів Діаметр стерильної зони, мм Середня МІК*, мкг Число штамів, чутливих до МІК Число чутливих штамів Діаметр стерильної зони, мм Середня МІК*, мкг Число штамів, чутливих до МІК Число чутливих штамів Діаметр стерильної зони, мм Середня МІК*, мкг Число штамів, чутливих до МІК
1 Debaryomyces castelii 4 4 19±0,3 5 2 1 15±0,5 5 1 1 16±0,5 5 1 1 11±0,5 10 1
2 D. hansenii 24 24 16±0,5 5 7 18 17±0,3 5 12 17 15±1,1 10 12 7 15±1,1 10 5
3 D. polymorphus 27 25 18±0,3 10 16 6 17±0,5 5 4 17 14±0,3 5 9 9 14±1,2 10 6
4 D. vanriji 17 15 20±0,5 5 12 13 14±0,3 5 6 16 10±1,2 10 15 3 13±0,5 10 2
5 Williopsis californica 17 3 12±0,3 10 2 4 21±1.0 4 2 11 15±1,1 5 8 3 16±1,1 5 2
6 W. saturnus 12 11 19±0,5 5 9 7 25±0,5 2 3 11 22±0,8 2 6 6 13±0,5 10 3
7 Kluyveromyces marxianus 29 27 25±0,3 2,5 19 28 19±0,5 5 13 27 15±0,5 5 21 17 17±1,1 7 10
8 K. dobzhanskii 6 6 28±0,3 0,5 3 6 29±0,5 1 4 6 29±1,4 1 2 6 16±1,1 10 3
9 K. lactis 5 5 29±0,5 1 3 5 18±0,5 3 4 5 25±0,8 2 4 5 10±0,5 10 3
10 Pichia anomala 24 24 16±0,5 5 12 20 11±0,5 10 11 18 18±0,8 4 14 6 17±0,3 5 4
11 P. guilliermondii 14 14 18±0,3 10 12 9 16±0,5 5 8 9 12±1,1 10 7 2 16±1,1 5 2
12 P. membranaefaciens 10 9 19±0,3 10 7 10 24±0,5 2 8 10 26±1,4 2 7 9 14±1,1 10 7
13 Saturnispora dispora 8 8 28±0,5 0,5 2 8 39±0,5 0,5 5 8 34±1,1 0,5 5 8 32±0,8 1 4
14 Saccharomyces cerevisiae 170 99 14±0,5 7,5 80 111 16±0,5 5 73 146 17±0,8 5 98 60 14±0,8 7,5 80
15 Schizosaccharomyces pombe 8 8 27±0,5 2 3 8 28±0,5 0,5 2 8 30±0,8 1 3 8 20±0,8 5 6
16 Candida albicans 13 6 13±0,5 10 4 12 19±0,5 5 12 11 19±0,6 5 7 12 15±0,8 5 10
17 C. kefyr 9 8 18±0,5 0,1 7 9 27±0,5 2,5 7 9 23±1,1 2,5 7 9 23±1,1 0,1 6
18 C. krusei 23 23 15±0,5 5 13 23 16±0,5 7,5 21 22 18±0,8 5 14 19 11±1,1 10 11
19 C. valida 11 8 22±0,5 5 5 11 11±0,5 10 11 11 15±1,2 5 7 9 9±0,8 10 7
20 C. lambica 15 15 18±0,8 5 10 15 13±0,5 10 14 14 13±1,2 10 9 11 11±0,5 10 9
21 C. rugosa 7 6 20±0,5 5 4 5 26±0,8 1 3 7 19±0,8 5 4 5 20±0,8 5 4
22 C. tropicalis 21 14 18±0,5 5 7 17 15±0,5 5 12 19 14±0,8 10 14 13 12±1,2 10 12
23 Rhodotorula minuta 4 4 27±0,5 2 1 4 20±0,5 2 2 4 21±0,8 2 2 4 15±0,8 5 2
24 Trichosporon cutaneum 31 29 22±0,8 5 16 16 17±0,3 5 11 17 11±0,8 10 12 7 10±1,4 10 5
В цілому ж слід відзначити невисоку специфічність досліджуваних штамів дріжджів за чутливістю до окремих трихотеценових мікотоксинів, однак для деяких таксонів чітко просліджується вибірковість щодо простих (Т-2 токсин), чи макроциклічних (веррукарин А, рорідини А і Н) трихотеценів. Відмічаються також таксони зі змішаною вибірковістю.
Високий відсоток чутливих штамів одного виду в більшості випадків характеризує його з точки зору спрямованості пошуку тест-культур. Однак, цей показник далеко не завжди корелює з їх високою активністю. Зважаючи на це, для оцінки відносної чутливості штамів одного виду поряд з таким показником як середній діаметр стерильної зони, використовувалась також середня мінімальна інгібуюча концентрація (МІК*), які, на нашу думку, суттєво доповнюють одна одну при оцінці чутливості як виду в цілому, так і окремих його штамів.
Так, надзвичайно високою чутливістю до досліджуваних мікотоксинів в умовах досліду, характеризувалась переважна більшість видів родів Saccharomyces, Kluyveromyces і окремі види Candida, Pichia, Rhodotorula.
Значний інтерес становлять дані щодо дослідження впливу мікотоксинів на характер їх дії на штами дріжджів. У зв'язку з цим, слід зазначити, що при досліджуваній концентрації різних трихотеценів була характерною фунгіцидна чи фунгістатична дія, або ж дія, яка супроводжувалась вторинним чи залежним ростом дріжджів.
Про значимість у пошуку індикаторних культур свідчить також показник числа штамів одного виду, чутливих до мінімальної інгібіторної концентрації. Чим менше значення коефіцієнту, що характеризує співвідношення числа досліджуваних штамів до таких, що чутливі до мінімальної інгібіторної концентрації, тим вірогідніший пошук культур для індикації конкретних мікотоксинів.
Таким чином, застосування при аналізі даних щодо антибіотичних властивостей комплексу ознак, таких як середній діаметр стерильної зони, мінімальна інгібіторна концентрація та число штамів, чутливих до мінімальної інгібіторної концентрації, поряд з іншими, дає можливість оцінити перспективність того чи іншого таксону щодо індикації мікотоксинів. Однак, жоден з цих показників не дає вичерпної відповіді на запитання щодо специфічної чутливості дріжджів до того чи іншого мікотоксину.
Для більш поглибленого вивчення штамів дріжджів, перспективних для визначення трихотеценових мікотоксинів, вивчали їх чутливість до широкого набору інших мікотоксинів. При цьому передбачалось встановити межі специфічної чутливості відібраних штамів, на основі яких можна створити банк тест-культур для мікробіологічного визначення мікотоксинів в різних субстратах.
За критерій оцінки високої чутливості використовували мінімальну інгібуючу концентрацію мікотоксинів, які викликали фунгіцидну дію щодо досліджуваних штамів. За результатами роботи встановлено широкий діапазон чутливості відібраних штамів відносно різних трихотеценів (табл. 2).
Виключно висока фунгіцидна активність характерна для макроциклічних трихотеценів, Т-2 токсину: значення мінімальної інгібуючої концентрації щодо найбільш чутливих штамів коливаються в межах 0,03 - 0,1; 0,1 - 1,0 і 0,2 - 0,1 мкг/диск. Менш виражена фунгіцидна активність для діацетоксисцирпенолу і дезоксиніваленолу: 0,8 - 5,0; 0,1 - 2,0; 0,8 - 4,0 мкг/диск. І незначна — для метаболітів Т-2 токсину і фузаренону-Х. Значення мінімальної інгібуючої концентрації для стійких щодо трихотеценів штамів D. polymorphus 396, P. guilliermondii 275 знаходилась в межах 5 - 15 мкг/диск
Одержані нами дані дають підстави для комплектування банку тест-культур дріжджів із широкими можливостями визначення мінімальних концентрацій трихотеценових мікотоксинів в контамінованих ними різних харчових і кормових субстратах, а також розробки на їх основі якісних і кількісних експрес-методів аналізу.
Таким чином, в результаті проведеної роботи із залученням до характеристики штамів комплексу ознак нами сформований список індикаторних культур дріжджів, який суттєво доповнює існуючий в лабораторії банк організмів для аналізу трихотеценових мікотоксинів (табл. 3).
Слід наголосити на тому, що не дивлячись на те, що на сьогодні розроблено цілий ряд інструментальних методів аналізу мікотоксинів, мікробіологічні методи залишаються виключно актуальними. Це обумовлено, перш за все, їх простотою, доступністю для масового аналізу, незначними фінансовими затратами. З іншого боку, застосування інструментальних методів пов'язане зі значними матеріальними затратами, в той час, як частота вияву мікотоксинів досить незначна. З огляду на це, мікробіологічний метод міг би бути дуже корисним і економічно виправданим для первинного виявлення мікотоксин-позитивних зразків.
При виконанні даної роботи нам вдалося виявити і деякі інші аспекти можливого практичного використання фунгістатичних властивостей мікотоксинів, і, зокрема, для розробки підходів до їх мікробіологічної інактивації. Ця ідея базувалась на вияві факту залежного росту дріжджів при обробці їх досліджуваними трихотеценами.
Такі штами були виявлені в невеликій кількості і лише в межах виду D. polymorphus. Так, один із штамів проявляв ріст, залежний від вуррукарину A і рорідину H, в той час як два інших — від рорідину A. Однак, найбільш показовим цей вид був в прояві залежного росту від Т-2 токсину. Таких штамів було виявлено 9. Залежний ріст вказує на їх здатність метаболізувати Т-2 токсин, а, відповідно, і на можливість їх використання як агентів детоксикації.
Таблиця 2
Мінімальні інгібуючі концентрації (мкг/диск) деяких трихотеценових мікотоксинів щодо досліджуваних штамів дріжджів
| 
