|
МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ’Я УКРАЇНИ
Київська медична академія післядипломної освіти
ім. П.Л. Шупика
ЦВЕЮК НАДІЯ ПЕТРІВНА
УДК 582.923.1: 615.451
ФАРМАКОГНОСТИЧНЕ ДОСЛІДЖЕННЯ
ТИРЛИЧУ ВАТОЧНИКОВИДНОГО
15.00.02 – фармацевтична хімія та фармакогнозія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фармацевтичних наук
Київ – 2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Івано-Франківському державному медичному університеті Міністерства охорони здоров’я України.
Науковий керівник: кандидат фармацевтичних наук, доцент
Грицик Андрій Романович
Івано-Франківський державний медичний університет,
завідувач кафедри фармації
Офіційні опоненти: доктор фармацевтичних наук, старший науковий співробітник
Маковецька Олена Юріівна
Медичний інститут Української асоціації народної медицини,
завідуюча кафедри фармацевтичної хімії та фармакогнозії
доктор фармацевтичних наук, професор
Мазулін Олександр Владиленович
Запорізький державний медичний університет,
професор кафедри фармакогнозії
Провідна установа: Національний фармацевтичний університет Міністерства охорони здоров’я України, кафедра фармакогнозії, м. Харків
Захист відбудеться “ 28 ” жовтня 2005 р. о 1100 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.613.04 при Київській медичній академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика за адресою: 04112, м. Київ, вул. Дорогожицька, 9.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика (04112, м. Київ, вул. Дорогожицька,9).
Автореферат розісланий “ 27 ” вересня 2005 р.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
доцент Л.Б. ПилипчукЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Пошуки та створення нових лікарських засобів рослинного походження, а також організація їх промислового виробництва – важливе завдання вітчизняної фармації. Особлива увага надається рослинам з багатовіковим досвідом використання в народній медицині, до яких належить тирлич жовтий (Gentiana lutea L.).
На українському фармацевтичному ринку зареєстровані і широко використовуються комплексні алопатичні і гомеопатичні препарати іноземних виробників, які вміщують сумарні екстракти коренів тирличу жовтого (Гербіон шлункові краплі, Трав’яний бальзам і Шведська гіркота Др. Тайса, Афлубін, Лімфоміозот). Застосовують їх при атонії і секреторній недостатності органів шлунково-кишкового тракту, анорексії, дискінезії жовчних шляхів, для загального зміцнення організму.
Вітчизняні виробники ліків не виготовляють препарати з тирличу жовтого, оскільки даний вид є рідкісним гірським європейським видом, який перебуває на межі зникнення. Сировина тирличу жовтого була включена до Державної Фармакопеї VIII видання, а в подальші видання не включена, тому що запаси її постійно скорочуються.
Актуальним є розробка впровадження в медичну практику нової лікарської рослинної сировини, яка може бути замінником офіцинальної сировини. Перпективним є дослідження тирличу ваточниковидного (Gentiana asclepiadea L.), який використовується в народній медицині нарівні з тирличем жовтим, широко розповсюджений на території Українських Карпат. Недостатнє хімічне та відсутні фармакологічні дослідження тирличу ваточниковидного, а також доступність сировини стали підставою для наших досліджень.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт Івано-Франківського державного медичного університету і є складовою частиною науково-дослідної теми: “Дослідження деяких дикорослих і культивованих рослин західного регіону України і вивчення можливості створення на їх основі лікарських засобів” (номер державної реєстрації 0103 U 004377).
Мета і завдання дослідження. Метою роботи є фармакогностичне дослідження тирличу ваточниковидного, вивчення можливості комплексного застосування рослинної сировини для створення лікарських засобів, а також розробка методів стандартизації сировини і препаратів за вмістом діючих речовин.
Для досягнення цієї мети ставили такі завдання:
- провести попереднє фітохімічне дослідження сировини тирличу ваточниковидного;
- виділити та ідентифікувати біологічно активні речовини (БАР) з трави і коренів тирличу ваточниковидного;
- розробити спосіб одержання і стандартизацію екстрактів з тирличу ваточниковидного;
- вивчити фармакологічні властивості екстрактів з рослинної сировини;
- вивчити можливість створення лікарських засобів з коренів і трави тирличу ваточниковидного;
- вивчити сировинні ресурси тирличу ваточниковидного;
- розробити проекти аналітичної нормативної документації (АНД) на сировину, інструкцій із заготівлі, сушіння і зберігання коренів і трави тирличу ваточниковидного.
Об’єкти дослідження: підземні і надземні органи тирличу ваточниковидного, водні та водно-спиртові екстракти, індивідуальні біологічно активні речовини.
Предмет дослідження: виділення, ідентифікація біологічно активних речовин тирличу ваточниковидного, створення на їх основі і стандартизація нового фітозасобу.
Методи дослідження. Біологічно активні речовини вивчали методами тонкошарової і паперової хроматографії в різних системах розчинників. Для виділення БАР з рослинної сировини використовували рідинну екстракцію, колонкову хроматографію на поліаміді, а також препаративну хроматографію на папері і в тонкому шарі сорбенту. Хімічну будову виділених речовин встановлювали методом УФ-спектрального аналізу за допомогою спектрофотометрів типу СФ-56 та Specord М40. Ресурсознавчі дослідження проводили з використанням методу модельних екземплярів. Висоту над рівнем моря визначали приладом GARMIN GPS 12. Для анатомічного дослідження листків тирличу ваточниковидного використовували мікроскоп Rathenow 83241, цифровий фотоапарат Minolta DImage X20. Фармакологічні дослідження проводили in vivo.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше проведено систематичні фітохімічні, фармакологічні і ресурсознавчі дослідження тирличу ваточниковидного. Ідентифіковано 8 речовин, серед яких флавоноїди, ксантон, фенолкарбонові кислоти. Проведено вивчення вмісту біологічно активних речовин коренів і трави тирличу ваточниковидного в залежності від фази вегетації і місця зростання рослини.
Опрацьовано оптимальні умови одержання сумарних екстрактів. Встановлено, що екстракти коренів і трави є нетоксичними і проявляють гепатозахисну і протизапальну активність.
Розроблений спосіб одержання екстракту з коренів тирличу ваточниковидного з гепатозахисною активністю, який захищено патентом на винахід № 70451А. На спосіб одержання екстракту з трави тирличу ваточниковидного, який проявляє гепатозахисну активність, отримано позитивне рішення про видачу деклараційного патенту на корисну модель (№ заявки u 2005 00556 від 21 січня 2005 р.)
Виявлені місця зростання рослини і встановлені запаси надземних і підземних органів.
Практичне значення одержаних результатів. Одержані фітохімічні та фармакологічні дані вказують на можливість використання коренів і трави тирличу ваточниковидного як лікарської рослинної сировини.
Розроблено проекти АНД “Тирличу ваточниковидного корені” і “Тирличу ваточниковидного трава”. Розроблено проекти інструкцій із заготівлі, сушіння і зберігання коренів і трави тирличу ваточниковидного.
Розроблено і затверджено Технічні умови України на корені тирличу (ТУ У 15.8-02010758-002-2003) і траву тирличу ваточниковидного (ТУ У 15.8-02010758-003-2003), згідно яких контролюється якість вихідної сировини при виробництві рослинних настоянок на Івано-Франківському обласному державному об’єднанні спиртової та лікеро-горілчаної промисловості.
За матеріалами роботи видані методичні рекомендації “Поширення і перспективи застосування тирличу ваточниковидного в медицині”, які впроваджені в навчальний процес і практичну роботу кафедри фармакології та фармації Буковинської державної медичної академії, кафедр фармації, фармакології з курсом клінічної фармакології ІФДМА, кафедр ботаніки, фармакогнозії Національного фармацевтичного університету, кафедри фармацевтичної хімії і фармакогнозії Київської медичної академії післядипломної освіти ім. П.Л.Шупика, кафедри фармакогнозії і ботаніки Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького, контрольно-виробничої лабораторії Івано-Франківського обласного державного об’єднання спиртової та лікеро-горілчаної промисловості (акти впровадження від 23.01.2004, 2.02.2004, 20.03.2004, 30.01.2004, 12.02.2004, 26.10.2004, 18.03.2004, 5.02.2004 відповідно).
Особистий внесок здобувача. Автором проведений аналіз літературних даних ботанічної характеристики, поширення тирличу ваточниковидного, хімічного складу і використання рослин роду тирлич;
- встановлені основні групи БАР, проведений їх кількісний аналіз в сировині по фазах вегетації і з різних місць зростання;
- виділено та ідентифіковано 8 речовин фенольної природи з трави тирличу ваточниковидного;
- розроблені способи одержання сумарних екстрактів та досліджена їх фармакологічна активність;
- проведена ресурсна характеристика тирличу ваточниковидного в Українських Карпатах;
- вивчено анатомічні діагностичні ознаки трави тирличу ваточниковидного.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи викладено на 7-му Міжнародному медичному конгресі студентів та молодих учених (Тернопіль, 2003), Міжнародній науковій конференції, присвяченій 100-річчю створення фармацевтичного факультету Запорізького державного медичного університету “Історія та перспективи розвитку фармацевтичної науки і освіти” (Запоріжжя, 2004), Х-му Конгресі СФУЛТ (Чернівці, 2004), І-й Міжнародній науково-практичній конференції “Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів і біологічно активних добавок” (Тернопіль, 2004), Науково-практичній конференції “Фармацевтичне право: організаційно-правові проблеми рецептурного та безрецептурного відпуску лікарських засобів в сучасних умовах” (Харків, 2004), Всеукраїнському науково-практичному семінарі “Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії” (Харків, 2004).
Публікації. За темою дисертації опубліковано 17 наукових праць, у тому числі 10 статей (з них 6 у наукових фахових виданнях), 1 методичні рекомендації, 1 патент на винахід, 5 тез доповідей.
Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу, огляду літератури, трьох розділів з результатами експериментальних досліджень, списку літературних джерел і додатків. Загальний обсяг дисертації складає 137 сторінок. Робота містить 21 рисунок, 47 таблиць, 19 додатків. Список використаних джерел літератури складає 120 найменувань, з них 35 іноземних.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Ботанічна характеристика, хімічний склад та
застосування тирличу ваточниковидного в медицині
В огляді літератури описано біологічні особливості тирличу ваточниковидного, умови проростання і культивування, хімічний склад, застосування в народній медицині. Рослина широко розповсюджена на території Українських Карпат, корені і трава тирличу ваточниковидного містять комплекс цінних біологічно активних речовин, здавна використовуються в народній медицині, і є перспективною сировиною для фітохімічного і фармакологічного дослідження з метою створення нових препаратів, враховуючи терапевтичну дію і забезпеченість сировинною базою.
Виявлення основних груп біологічно активних речовин
надземних і підземних органів тирличу ваточниковидного
За допомогою реакцій ідентифікації та паперової хроматографії в траві, листках, квітах, коренях і кореневищах тирличу ваточниковидного виявлені вільні цукри, водорозчинні поліцукри, аскорбінова кислота, фенолкарбонові кислоти, іридоїди, алкалоїди, флавоноїди, ксантони, 6 органічних кислот, від 6 до 11 амінокислот в залежності від виду сировини. Основними біологічно активними речовинами надземних і підземних органів є фенольні сполуки і поліцукри.
Для виділення, розділення і одержання індивідуальних речовин з сировини тирличу ваточниковидного використовували методи рідинної екстракції, адсорбційної хроматографії на поліаміді, кристалізації, препаративної хроматографії на папері. При встановленні структури виділених речовин використовували УФ-спектроскопію та хімічні методи: лужний гідроліз, лужну та йодистоводневу деструкцію, лактонізацію. В результаті проведеного дослідження з трави тирличу ваточниковидного виділено 8 сполук. Основні фізико-хімічні властивості речовин, виділених з трави тирличу ваточниковидного, наведені в табл. 1. Стандартні зразки було надано проф. Ковальовим В.М., завідувачем кафедри фармакогнозії Національного фармацевтичного університету.
Таблиця 1
Фізико-хімічні властивості речовин, виділених
з трави тирличу ваточниковидного
Примітки: 1. А – н-бутанол-оцтова кислота-вода (4:1:2);
2. Б – 2,5% оцтова кислота;
3. В – 6% оцтова кислота;
4. Г – 15% оцтова кислота;
5. Д – 30% оцтова кислота.
Речовини Ф1 і Ф2 за результатами якісних реакцій, хроматографічною рухливостю в різних системах розчинників, а також одержаних максимумів поглинання в УФ-області спектру нами віднесено до агліконів флавоноїдів. На основі вивчених фізико-хімічних властивостей досліджуваних речовин, а також порівняння з достовірними зразками виділена речовина Ф1 ідентифікована як апігенін, а Ф2 – як лютеолін.
Речовини Ф3 і Ф4 за результатами реакцій ідентифікації, хроматографічною рухливістю, флуоресценцією плям на хроматограмах в УФ-світлі до і після проявлення хромогенними реактивами віднесено до флавоноїдних глікозидів. Дані речовини стійкі до кислотного гідролізу, тому віднесені нами до С-глікозидів. При проведенні деструкції йодистоводневою кислотою в середовищі рідкого фенолу і оцтового ангідриду досліджувані сполуки розщеплювалися на дві речовини. В продуктах гідролізу речовини Ф3 виявлено апігенін і D-глюкозу, в продуктах гідролізу речовини Ф4 – лютеолін і D-глюкозу. Речовина Ф3 за фізико-хімічними властивостями і продуктами гідролізу ідентифікована як апігенін-6-С-в-глюкозид (ізовітексин). Змішана проба речовини Ф4 з достовірним зразком ізоорієнтину не викликала депресії температури топлення і на хроматограмах давала по одній нероздільній плямі. Речовина Ф4 була ідентифікована як лютеолін-6-С-в-глюкозид (ізоорієнтин).
Речовина К1 глікозидної природи віднесена до ксантонів. В УФ-світлі на хроматограмах проявляється у вигляді оранжевої плями, яка після обробки парами аміаку набуває лимонно-жовтого забарвлення. Дана речовина стійка до кислотного гідролізу, тому віднесена нами до С-глікозидів. Змішана проба виділеної речовини і достовірного зразка мангіферину не викликала депресії температури топлення і на хроматограмах давала одну нероздільну пляму. Виділену речовину ідентифіковано як 1,3,6,7-тетрагідроксиксантон-2-С-глюкозид (мангіферин).
Речовини ФК1, ФК2 і ФК3 за флуоресценцією плям на хроматограмах у фільтрованому УФ-світлі та встановленими максимумами поглинання УФ-спектрів віднесені нами до фенолкарбонових кислот. В продуктах лужної деструкції речовин ФК1 і ФК2 виявлено протокатехову кислоту, речовини ФК3 – ванілінову кислоту. Лужний гідроліз речовин ФК1 і ФК2 приводить до утворення кофейної та D-хінної кислот. Місце приєднання кофейної кислоти до D-хінної встановлено за результатами лактонізації виділених речовин під впливом льодяної оцтової кислоти. Утворення лактону хінідину відбувалося тільки з речовини ФК2, що вказує на наявність вільної гідроксигрупи у С-5 положенні D-хінної кислоти. Отже, в молекулі речовини ФК1 залишок кофейної кислоти приєднаний в положенні С-5 до D-хінної кислоти, а в речовини ФК2 – в положенні С-3. На основі проведених досліджень і результатів порівняння з достовірними зразками речовина ФК1 ідентифікована як хлорогенова кислота, ФК2 – неохлорогенова кислота, ФК3 – ферулова кислота.
Кількісне визначення різних груп біологічно активних речовин
тирличу ваточниковидного
При дослідженні полісахаридів осадження фракцій водорозчинних полісахаридів (ВРПС) з водних витяжок, пектинових речовин (ПР) з кислих витяжок і геміцелюлоз (ГЦ) з лужних витяжок проводили за допомогою ацетону. Вихід вуглеводних фракцій з коренів, кореневищ, трави, листків і квітів тирличу ваточниковидного наведено на рис. 1.
Рис. 1. Вміст виділених фракцій полісахаридів в надземних і підземних органах тирличу ваточниковидного.
Максимальна кількість водорозчинних полісахаридів міститься в листках (1,85%), геміцелюлози найбільше в траві (6,97%), пектинових речовин – в кореневищах (2,78%). Після гідролізу у фракціях ВРПС за допомогою паперової хроматографії виявлено глюкозу, фруктозу, генціанозу, в ПР – фруктозу, глюкозу і глюкуронову кислоту.
В підземних і надземних органах тирличу ваточниковидного, заготовлених в різні пори року, методом атомно-абсорбційної спектроскопії досліджували вміст 9 елементів: заліза, магнію, цинку, марганцю, кобальту, міді, літію, хрому, кадмію. Встановлено, що в коренях максимальний вміст практично всіх досліджуваних елементів накопичується під час масової вегетації. У траві кількісний вміст більшості елементів не змінювався протягом досліджуваних періодів вегетації.
При вивченні впливу умов зростання на елементний склад тирличу ваточниковидного встановлено, що із збільшенням висоти над рівнем моря в коренях менше накопичується магнію, хрому і марганцю, у траві знижується вміст практично всіх досліджуваних елементів.
З метою встановлення термінів заготівлі рослинної сировини тирличу ваточниковидного, раціонального використання, а також розробки можливих методів її стандартизації нами проведено визначення показника гіркоти і кількісного вмісту суми поліфенольних сполук, суми г-піронів, аскорбінової та органічних кислот в надземних і підземних органах рослини, заготовлених у різні фази вегетації.
Методику кількісного визначення суми γ-піронів модифіковано. За стандартний зразок було вибрано ксантоновий глікозид мангіферин. Встановлено, що максимуми поглинання комплексних сполук мангіферину-стандарту і водно-спиртової витяжки трави тирличу ваточниковидного з алюмінію (ІІІ) хлоридом співпадають при 410 нм (рис.2).
Рис. 2. УФ-спектри комплексів мангіферину (1) і водно-спиртової витяжки трави тирличу ваточниковидного (2) з алюмінію (ІІІ) хлоридом.
При виборі умов проведення реакції комплексоутворення з алюмінію (ІІІ) хлоридом, встановлено, що оптимальним об’ємом для нанесення на колонку є 1 мл екстракту, співвідношення елюату з колонки і розчину комплексоутворювача 1:1, стійкість комплексу зберігається 20-30 хв. Відносна похибка методу не перевищує ±3,58 %.
Визначення вмісту аскорбінової та органічних кислот в сировині тирличу ваточниковидного проводили згідно з методиками ДФ ХІ. Вміст суми поліфенольних сполук в сировині тирличу ваточниковидного в перерахунку на хлорогенову кислоту визначали фотоколориметричним методом.
Результати досліджень вмісту БАР в коренях і траві тирличу ваточниковидного, заготовлених у різні фази вегетації, наведені на рис. 3.
Вміст суми г-піронів у траві тирличу ваточниковидного становить 0,20-0,59% в залежності від фази вегетації. Найбільше аскорбінової кислоти та органічних кислот нагромаджується в траві під час масової вегетації (0,19% і 0,65%), в коренях – на початку вегетації (0,10% і 0,42%). Максимальний вміст поліфенольних сполук в траві накопичується в період масового цвітіння (10,79%), в коренях – в період відмирання надземної частини (3,60%). Одержані дані використані при встановленні оптимальних термінів заготівлі рослинної сировини тирличу ваточниковидного: для коренів – фаза відмирання надземної частини, для трави – фаза цвітіння.
| 
