|
Міністерство охорони здоров’я україни
Національний фармацевтичний університет
Шпичак Олег Сергійович
УДК: 615.23:615.014.24:615.32:616.002.5
РОЗРОБКА СКЛАДУ ТА ТЕХНОЛОГІЇ НОВОГО КОМПЛЕКСНОГО ПРИРОДНОГО ПРЕПАРАТУ З АНТИМІКРОБНИМИ
ТА ІМУНОМОДуЛЮЮЧИМИ ВЛАСТИВОСТЯМИ
15.00.01 – технологія ліків та організація фармацевтичної справи
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фармацевтичних наук
Харків – 2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана на кафедрі аптечної технології ліків Національного фармацевтичного університету Міністерства охорони здоров'я України.
Захист відбудеться "18" березня 2005 року о 1000 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.605.01. при Національному фармацевтичному університеті за адресою: 61002. м. Харків, вул. Пушкінська, 53.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного фармацевтичного університету (61168, м. Харків, вул. Блюхера, 4).
Автореферат розісланий "_15" лютого 2005 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради
доктор біологічних наук, професор Л.М. Малоштан
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Розширення асортименту готових лікарських засобів має першорядне значення у справі медичного забезпечення населення високоефективними препаратами для лікування ряду захворювань. Вирішенню цієї проблеми сприяє пошук і впровадження нових оригінальних лікарських засобів та науково обґрунтована технологія їх виготовлення на підставі останніх досягнень науки і техніки. Важливу роль у цьому відношенні відіграють сполуки природного походження, зокрема, продукти бджільництва, особливо біомаса великої бджолиної вогнівки (БВБВ) препарати якої виявляють виражену імуномодулюючу та антимікробну активність.
З даних літератури відомо, що на початку ХХ століття видатний російський вчений І.І. Мечников досліджував личинки бджолиної вогнівки з метою створення протитуберкульозної вакцини. Дослідження І.І. Мечникова були продовжені його учнем проф. С.І. Метальниковим, який, вивчаючи імунітет бджолиної вогнівки, продемонстрував надзвичайно високу стійкість її личинок по відношенню до мікобактерій туберкульозу та деяких інших патогенних мікроорганізмів.
В літературних джерелах є також відомості про застосування в терапії органів дихальної системи та деяких форм туберкульозу лікарської рослинної сировини (ЛРС), яка підсилює фармакологічну дію препаратів означеної направленості та знижує їх побічні ефекти.
У зв'язку з цим, розробка складу та технології нового природного комплексного препарату у вигляді складної настойки на основі БВБВ та ЛРС є актуальною.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана згідно з планом науково-дослідницьких робіт Національного фармацевтичного університету (№ держреєстрації 0103U000476) та за пріоритетним Державним замовленням МОЗ України "Створення та впровадження в медичну практику протитуберкульозних препаратів на основі похідних хіноліну, його фторованих аналогів і прополісу" (№ держреєстрації 0102U0041197).
Мета і завдання дослідження. Метою роботи є теоретичне і експериментальне обґрунтування складу та розробка технології комплексного лікарського препарату на основі БВБВ та ЛРС у формі складної настойки.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні завдання:
- проаналізувати і узагальнити сучасні дані літератури щодо застосування природних імуномодулюючих засобів в терапії захворювань верхніх дихальних шляхів та туберкульозу;
- розробити та затвердити технічні умови на БВБВ;
- провести біофармацевтичні дослідження з метою обґрунтування оптимального складу комплексного препарату;
- розробити технологію лікарського препарату у вигляді складної настойки на основі БВБВ та ЛРС;
- вивчити фізико-хімічні властивості, провести якісне та кількісне визначення біологічно-активних речовин, встановити термін, умови зберігання та стабільність настойки;
- розробити проекти аналітичної нормативної документації (АНД) та технологічного регламенту на лікарський препарат;
- провести фармакологічні та мікробіологічні дослідження комплексного препарату: визначити імуномодулюючу, антимікробну, протитуберкульозну дію, та гостру і хронічну токсичність досліджуваного лікарського препарату.
Об'єкт дослідження. Об’єктом дослідження є комплексний препарат у формі складної настойки на основі БВБВ та ЛРС.
Предмет дослідження. Предметом дослідження є розробка складу та технології комплексного препарату з імуностимулюючою, антимікробною та протитуберкульозною дією.
Методи дослідження. Визначення фізико-хімічних, технологічних, мікробіологічних та статистичних показників одержаного препарату проводили за загальновизнаними методиками. Для ідентифікації препарату використовували методи паперової, тонкошарової, рідинної та газорідинної хроматографії, атомно-адсорбційної спектроскопії, УФ-спектроскопії, кольорові та осадові реакції; для кількісного визначення суми основних діючих речовин – метод спектрофотометрії.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше теоретично і експериментально обґрунтовано склад та технологію нового комплексного лікарського препарату з антимікробними та імуномодулюючими властивостями на основі біологічно активних речовин БВБВ та ЛРС під умовною назвою "Мелофіт", а також вивчено фізико-хімічні властивості, якісний склад і кількісний вміст основних діючих біологічно-активних речовин одержаного препарату.
Якісними реакціями та методами паперової, тонкошарової, рідинної, газорідинної хроматографії, УФ-спектроскопією, атомно-адсорбційною спектроскопією встановлено склад груп біологічно активних речовин одержаного препарату: амінокислоти, екдистероїди, жирні кислоти, фенольні сполуки (флавоноїди, дубильні речовини, прості феноли та ін.), мікроелементи, пігменти (хлорофіли та каротиноїди), а також визначено їх спектральні характеристики.
З використанням сучасних фізико-хімічних методів аналізу запропоновано методики якісної ідентифікації та кількісного визначення вмісту основних діючих речовин розробленого препарату, вивчено його імуностимулюючу, антимікробну та протитуберкульозну активність, визначено умови та термін зберігання, а також обґрунтовано розділи аналітичної нормативної документації, які регламентують їх якість.
Встановлено, що розроблений комплексний препарат "Мелофіт" за своїми характерними фармакологічними властивостями поєднує широкий спектр антимікробної активності на грампозитивні та грамнегативні бактерії, мікобактерії туберкульозу та патогенні гриби. Антимікробні властивості поєднуються з імуностимулюючим впливом на системи неспецифічної резистентності та імунореактивності.
Експериментально обґрунтована доцільність використання комплексного препарату "Мелофіт" як імуномодулятора при специфічній профілактиці туберкульозу вакциною БЦЖ.
Новизна досліджень підтверджена пріоритетними висновками на заявки до патентів (№ 20040402784 від 04.06.2004 "Спосіб одержання протитуберкульозного засобу "Гретавоск"; № 20040806453 від 22.09.2004 "Фармацевтична композиція "Мелофіт" з протитуберкульозною та імуномодулюючою дією").
Практичне значення одержаних результатів. Розроблено склад та технологію комплексного природного препарату з імуностимулюючою, антимікробною та протитуберкульозною дією у формі складної настойки на основі біологічно активних речовин БВБВ та ЛРС.
Розроблено проекти аналітичної нормативної документації (АНД) та технологічного регламенту на комплексний препарат під умовною назвою "Мелофіт", а також затверджено ТУ У 01.2-00729557.002-2002 на біомасу великої бджолиної вогнівки (Galleria Mellonella).
Розроблено та апробовано технологію одержаного лікарського препарату в умовах лабораторного і промислового виробництва, що викладено в технологічних інструкціях та технологічному регламенті на виробництво препарату, які апробовані в умовах ТОВ "Фармацевтична компанія "Здоров’я".
Проведено доклінічні фармакологічні та мікробіологічні дослідження розробленого препарату. Фрагменти роботи впроваджено до навчального процесу кафедри технології ліків Запорізького Державного медичного університету, кафедри технології ліків і біофармації Львівського Національного медичного університету ім. Данила Галицького, кафедри аптечної та промислової технології ліків Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця (м. Київ), кафедри технології ліків інституту Української асоціації народної медицини (м. Київ) та кафедри технології ліків Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевського. Впровадження підтверджені відповідними актами впровадження.
Особистий внесок дисертанта. Автором особисто проведено:
- аналіз сучасних даних літератури щодо застосування природних імуномодулюючих засобів в терапії захворювань верхніх дихальних шляхів та туберкульозу, а також проаналізовано сучасні літературні джерела, що стосуються епідеміологічної ситуації з туберкульозу на Україні та за її межами;
- обґрунтовано склад і розроблено оптимальну технологію нового комплексного природного препарату у вигляді складної настойки з БВБВ та ЛРС для виготовлення в промислових умовах;
- розроблено методики контролю якості одержаного препарату;
- на підставі проведених експериментальних досліджень розроблено проекти АНД та технологічного регламенту на виробництво настойки "Мелофіт";
- узагальнено результати експериментальних досліджень та сформульовано висновки.
Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи доповідалися на: науково-практичній конференції "Ліки – людині" (м. Харків, 2002 р.), Міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених "Вчені майбутнього" (м. Одеса, 2002 р.), Всеукраїнській науково-практичній конференції "Фармація XXI століття" (м. Харків, 2002 р.), науково-практичній конференції "Интеграция образования, науки и производства в фармации" (м. Ташкент, 2002), II з’їзді Апітерапевтів України (м. Харків, 2002 р.), міжобласній науково-практичній конференції "Актуальні проблеми фармації" (м. Запоріжжя, 2003 р.), міжвузівській науковій конференції студентів та молодих вчених (м. Харків, 2003 р.), ІІІ Міжнародній науково-практичній конференції "Наука і соціальні проблеми суспільства: медицина, фармація, біотехнологія" (м. Харків, 2003 р.), науково-практичній конференції з міжнародною участю "Створення, виробництво, стандартизація, фармакоекономіка лікарських засобів та біологічно активних добавок" (м. Тернопіль, 2004 р.) та на Всеукраїнському науково-практичному семінарі "Перспективи створення в Україні лікарських препаратів різної спрямованості дії" (м. Харків, 2004 р.).
Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 18 робіт, у тому числі 6 статей в наукових фахових журналах та 12 тез доповідей.
Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 165 сторінках друкованого тексту і складається зі вступу, огляду літератури (розділ 1), розділу, що присвячений обгрунтуванню загальної концепції і методів досліджень (розділ 2), експериментальної частини (розділи 3-5), загальних висновків, списку використаних літературних джерел та додатків. Робота ілюстрована 13 рисунками і 35 таблицями. Список використаних джерел містить 171 найменування, у тому числі 31 іноземних авторів.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Розробка складу та технології комплексного препарату на основі
біологічно активних речовин БВБВ та ЛРС
На першому етапі створення препарату нами були проведені дослідження зі стандартизації БВБВ та встановлено її основні показники якості: зовнішній вигляд, колір, масову частку сухих речовин, концентрацію іонів водню (рН) водного розчину біомаси, мікробіологічні показники, вміст токсичних елементів, вміст залишкових кількостей пестицидів та радіоактивних нуклідів. На основі проведених експериментальних досліджень, було розроблено та затверджено технічні умови на БВБВ.
Наступним етапом нашої роботи було проведення досліджень по обґрунтуванню складу комплексного препарату з БВБВ та ЛРС, а також вибору оптимальних параметрів екстрагування природної сировини.
На даний час для виробництва настойок на хіміко-фармацевтичних підприємствах застосовують статичні рівноважні способи екстрагування – мацерацію і ремацерацію, та динамічні способи екстрагування – перколяцію та вакуум-фільтраційну екстракцію.
Аналізуючи ці способи та враховуючи сучасний стан хіміко-фармацевтичного виробництва, а також хімічний склад досліджуваної сировини, ми зупинились на вивченні зазначених вище методів отримання настойок.
Таблиця 1
Вплив концентрації екстрагенту і співвідношення сировина:готовий
продукт на вихід екстрактивних речовин та антимікробну активність
витяжок з БВБВ (m=3)
Примітка: * – активність знижена за рахунок розведення розчину
При вивченні умов екстракції БВБВ, як екстрагент було використано водно-спиртову суміш із вмістом 40, 70 та 90 відсотків спирту етилового. Співвідношення сировина : екстрагент складало 1:10.
В результаті експериментальних досліджень (табл. 1) було встановлено, що підвищення концентрації спирту етилового у витяжках з БВБВ приводить до збільшення виходу екстрактивних речовин: 40 %-ний спирт етиловий вилучає 1,26 %, 70 %-ний – 1,64 %; а 90 %-ний – 1,70 %.
Таким чином, оптимальним екстрагентом для приготування витяжки з БВБВ слід вважати спирт етиловий у концентрації 70 %, який за виходом екстрактивних речовин практично не поступається 90 %. Крім того, зразок, виготовлений на 70 %-ному спирті етиловому, за антимікробними властивостями має певні переваги над іншими зразками, особливо по відношенню до мікроорганізмів роду P. aeruginosa. Експериментальні дані наведені в табл. 2.
Таблиця 2
Визначення антимікробної активності експериментальних зразків
з БВБВ методом дифузії в агар
Примітка: * – активність відсутня
Як відомо, однією з умов максимального виснаження природної сировини разом з вибором екстрагенту є також вибір оптимального співвідношення сировини і екстрагенту. В зв’язку з цим, нами були приготовлені витяжки у традиційних для настойок співвідношеннях 1:5 та 1:10 з використанням як екстрагент водно-спиртової суміші із вмістом 40, 70 і 90 % спирту етилового (коефіцієнт поглинання сировиною спирту етилового складає 0,114). Експериментальні зразки витяжок готували в лабораторних умовах методом мацерації.
В отриманих витяжках з БВБВ визначали вміст екстрактивних речовин та піддавали дослідженням на антимікробну активність по відношенню до мікроорганізмів роду P. aeruginosa. Результати експерименту (табл. 1) показали, що максимальна кількість екстрактивних речовин (3,63 %) екстрагується 90 %-ним спиртом етиловим у співвідношенні 1:5. Зразок, який містить 70 % спирту етилового у співвідношенні 1:5, вилучає дещо меншу кількість екстрактивних речовин (3,24 %), але значно перевищує антимікробні властивості аналогічних зразків по відношенню до P. aeruginosa (діаметр зони затримки росту складає 28,00±0,01 мм).
Враховуючи динаміку вилучення екстрактивних речовин та антимікробні властивості зразків, слід зазначити, що оптимальним екстрагентом є спирт етиловий у концентрації 70 %. Співвідношення сировина : екстрагент – 1:5.
Для визначення оптимального терміну екстракції БВБВ, нами було приготовлено 11 серій зразків методом мацерації на 70 %-ному спирті етиловому. В ході експерименту, через кожну добу відбирали одну серію витяжок та визначали в них вміст екстрактивних речовин і густину (табл. 3).
Таблиця 3
Вплив терміну екстракції на вихід
екстрактивних речовин і густину витяжок з БВБВ (m=5)
Поступове збільшення концентрації екстрактивних речовин і густини у витяжках з БВБВ спостерігалось до 7-ї доби, що відповідно складає 1,57±0,02 % і 0,9130±0,0002 г/см3. Після зазначеного періоду, далі показники практично не змінювались.
Таким чином, було встановлено оптимальні параметри екстракції для розробленої витяжки з БВБВ: екстрагент – 70 % спирт етиловий; співвідношення сировина : екстрагент – 1:5; час настоювання – 7 діб; метод екстракції – мацерація.
Як відомо з літературних джерел, дія імуномодулюючих природних засобів дещо підсилюється за рахунок поєднання їх з ЛРС. З цією метою нами було відібрано 4 найбільш поширених зборів з ЛРС, які застосовуються при лікуванні захворювань органів дихальної системи та туберкульозу легень. Склади зборів з ЛРС наведені в табл. 4.
З метою вивчення впливу часу на процес екстракції та вилучення екстрактивних речовин з запропонованих складів з ЛРС (табл. 4), нами було виготовлено 11 серій витяжок. Як екстрагент використовували 70 % спирт етиловий. Співвідношення сировина : екстрагент – 1:10, метод екстракції – мацерація.
Експериментальні дані, які наведені в табл. 5 свідчать про те, що максимальне вилучення екстрактивних речовин для витяжок складу №№ 1, 2 та 4 – складає 11 діб, а для витяжки складу №3 – 13 діб.
Таблиця 4
Склади зборів з ЛРС, які застосовуються при захворюваннях органів
дихальної системи та туберкульозу легень
Таблиця 5
Вплив терміну екстракції на концентрацію
екстрактивних речовин витяжок з ЛРС (m=5)
Примітка: *1,2,3,4 – склади витяжок, які наведені в табл. 4.
З метою вибору раціонального складу лікарського препарату, нами були приготовлені суміші витяжок з БВБВ та зборів з ЛРС у співвідношенні 1:1.
Таблиця 6
Визначення антимікробної активності витяжок з ЛРС
методом двократних серійних розведень
Результати антимікробної активності складних витяжок з БВБВ та ЛРС, які наведені в табл. 6 свідчать, що найбільшу антибактеріальну активність по відношенню до грампозитивних мікроорганізмів проявляє витяжка складу № 3.
Необхідно зазначити, що проведеними дослідженнями з використанням методу мацерації, нами було лише встановлено склад та співвідношення компонентів комплексного препарату:
Кореневищ з коренями солодки голої 10,0
Трави фіалки триколірної 10,0
Трави звіробою звичайного 10,0
Спирту етилового 70 % достатня кількість, для одер-
жання 300 мл витяжки з ЛРС
Витяжки з біомаси великої бджолиної вогнівки 300 мл
Комплексного препарату "Мелофіт" 600 мл
Відомо, що метод мацерації є тривалим і не дозволяє вилучити максимальну кількість БАР з ЛРС. Тому, подальші дослідження були направлені на вибір сучасного методу екстрагування рослинної сировини в умовах промислового виробництва фітохімічних засобів. З цією метою витяжки з ЛРС одержували методами мацерації, перколяції, та фільтраційної екстракції.
Фільтраційну екстракцію проводили в секторі хімії та технології фітохімічних препаратів на базі ДП ДНЦЛЗ під керівництвом д.хім.н., проф. В.І. Литвиненка. При мацерації – співвідношення сировина : екстрагент складало 1:10, а при перколяції та фільтраційній екстракції – 1:5.
За експериментальними даними (табл. 7), вихід екстрактивних речовин у витяжці з ЛРС, яку отримано методом вакуум-фільтраційної екстракції по відношенню до витяжки приготовленої методом мацерації збільшився майже в 6,3 рази, а по відношенню до витяжки, приготовленої методом перколяції – в 1,2 рази. Для визначення кількості зливів, в методі вакуум-фільтраційної екстракції проводили експеримент для кожного виду сировини. Результати досліджень, які наведені в табл. 8 показують, що сума екстрактивних речовин після 5-ти зливів становить близько 16 % в сумарній витяжці з ЛРС.
На підставі отриманих даних, нами була розроблена технологічна схема процесу одержання комплексного препарату "Мелофіт", яка наведена на рис. 1.
Рис. 1. Технологічна блок-схема виробництва комплексного препарату "Мелофіт"
Таблиця 7
Вихід екстрактивних речовин витяжки з ЛРС складу № 3,
отриманої різними методами екстракції
Таблиця 8
Визначення суми екстрактивних речовин в досліджених
зразках з ЛРС (m=5)
Таким чином, найбільш раціональною та оптимальною технологією отримання витяжки з ЛРС є метод вакуум-фільтраційної екстракції.
Фізико-хімічні дослідження, та аналіз якісного складу і кількісного
вмісту біологічно активних речовин розробленого комплексного препарату
Для розробки АНД на комплексний препарат "Мелофіт", нами було вивчено його органолептичні властивості, проведено фізико-хімічні дослідження, та аналіз якісного складу і кількісного вмісту біологічно-активних речовин (БАР).
За фізико-хімічними показниками настойка "Мелофіт" являє собою рідину темно-коричневого кольору, гіркого смаку з характерним спиртовим запахом. Вміст екстрактивних речовин складає – 16,30±0,04 %, відносна густина – 0,9139±0,0008, рН – 5,89±0,04, концентрація спирту етилового – 65±0,06 %.
За допомогою методів аналізу (паперової, тонкошарової, рідинної, газорідинної хроматографії, атомно-адсорбційної спектроскопії, спектрофотометрії) було встановлено якісний склад і кількісний вміст таких біологічно активних речовин як амінокислоти, екдистероїди, жирні кислоти, фенольні сполуки (флавоноїди, дубильні речовини, прості феноли та ін.), мікроелементи, пігменти (хлорофіли та каротиноїди).
Вивчення амінокислотного складу настойки "Мелофіт" проводили методами паперової, тонкошарової та рідинної хроматографії. Результати рідинної хроматографії (табл. 9) показали, що в препараті міститься 28 речовин, до складу яких увійшли замінні та незамінні амінокислоти, а також похідні амінокислот (сульфоамінокислоти, аміноспирти, амінопохідні адіпінової кислоти, фрагменти розщеплення білка – уреїди), що підкреслює його терапевтичну цінність.
Таблиця 9
Амінокислоти та їх похідні, які виявлено у комплексному препараті
"Мелофіт" методом рідинної хроматографії
| 
