|
ОДЕСЬКА НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ ХАРЧОВИХ ТЕХНОЛОГІЙ
ПЕТРОСЬЯНЦ АРСЕН ПЕДРОСОВИЧ
УДК 577.152.3
РОЗРОБКА БІОТЕХНОЛОГІЇ
ОТРИМАННЯ ГІДРОЛІТИЧНОГО ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТУ
З α-ГАЛАКТОЗИДАЗНОЮ АКТИВНІСТЮ
Спеціальність 03.00.20 – біотехнологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата технічних наук
Одеса – 2003
Дисертацією є рукопис
Робота виконана в Одеській національній академії харчових технологій,
Міністерство освіти і науки України
Науковий керівник: доктор технічних наук, професор,
лауреат Державної премії України
Капрельянц Леонід Вікторович,
Одеська національна академія харчових технологій,
завідувач кафедри біохімії та мікробіології
Офіційні опоненти: доктор технічних наук, професор
Безусов Анатолій Тимофійович,
Одеська національна академія харчових технологій,
завідувач кафедри технології консервування;
кандидат технічних наук
Ямборко Ганна Валентинівна,
Одеській національний університет ім. І.І. Мечникова,
доцент кафедри мікробіології і вірусології
Провідна установа: Національний університет харчових технологій, кафедра технології функціональних харчових продуктів (м. Київ), Міністерство освіти і науки України
Захист відбудеться 17.12 2003 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 41.088.02 Одеської національної академії харчових технологій (65039, м. Одеса, вул. Канатна, 112).
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Одеської національної академії харчових технологій (м. Одеса, вул. Канатна, 112).
Автореферат розісланий 14.11. 2003 року.
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Станкевич Г.М.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
В даний час в Україні, як і за кордоном, проводяться дослідження, які направлені на розширення асортименту харчових продуктів функціонального призначення. Удосконалення асортименту та формування якісних показників функціональних продуктів харчування може бути досягнуто широким використанням соєпродуктів.
Завдяки різноманітності біологічно активних інгредієнтів сої (білки, ліпіди, вуглеводи, вітаміни, мінеральні речовини, фітокомпоненти), вона є ідеальним функціональним продуктом, який використовується в дієтичному, лікувально-профілактичному та раціональному харчуванні. Соєпродукти є також одним з основних джерел різноманітних біологічно активних добавок, що використовуються як лікувально-профілактичні засоби при багатьох захворюваннях.
Сьогодні існує багато різноманітних технологій переробки соєвих бобів в продукти і інгредієнти харчування. У створенні сучасних технологій значне місце належить харчовій біотехнології, яка дозволяє створювати нові покоління вітчизняних продуктів, що відповідають вимогам так званих “здорових продуктів”.
Актуальність теми. У сучасній інженерній ензимології особливо актуальними є питання активності і специфічності ферментів, дослідження біосинтезу їх різними продуцентами, фізико-хімічних властивостей, механізму дії ферментів. Розв’язання цих питань має не тільки фундаментальне значення, але й практичне з точки зору раціонального використання ферментних препаратів та інтенсифікації технологічних процесів, направленої модифікації компонентів сировини при виробництві харчових продуктів та інгредієнтів.
Серед гідролітичних ферментів, що знайшли своє застосування при переробці рослинної сировини, важливе місце посідає α-галактозидаза.
Питанням дослідження властивостей цього ферменту та його використання присвячені праці багатьох закордонних учених. У нашій країні ведуться окремі розвідувальні роботи. Субстратом для α-галактозидази є αгалактозиди, включаючи рафінозу, стахіозу та інші, які є основними олігосахаридами сої. Препарати αгалактозидази насамперед знаходять широке застосування при переробці сої. Галактоолігосахариди (переважно рафіноза) викликають у деяких людей небажані дисфункції шлунково-кишкового тракту. З іншого боку, існують докази, що ці олігосахариди мають пребіотичні властивості, збільшуючи число біфідобактерій у товстому кишечнику.
Якщо за допомогою α-галактозидази розщепити соєві галактоолігосахариди до галактози та інших низькомолекулярних вуглеводів, то ця суміш матиме солодкий смак. Обробка соєпродуктів, що широко застосовуються сьогодні в раціонах харчування, α-галактозидазою робить перспективною розробку нових дієтичних соєпродуктів, а також утилізацію різних побічних продуктів їх виробництва. У зв’язку з вищевказаним актуальною є розробка отримання ферментного препарату з α-галактозидазной активністю.
Зв’язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає тематиці міжвузівської програми науково-дослідної роботи № 31 “Будова, склад, властивості і перетворення компонентів рослинної сировини як основи створення поліфункціональних добавок, збагачувачів і модулів при одержанні продуктів з новими властивостями, які забезпечують продовольчу безпеку населення України”, затвердженої наказом Міністерства освіти України № 271 від 15.08.96, зокрема темі досліджень проблемної лабораторії Одеської національної академії харчових технологій 1/2000-П “Фізико-хімічні та біотехнологічні основи одержання фітоферментних комплексів, симбіотиків, каротиноїдів та поліфенолів як компонентів біологічно активних добавок” (№ держреєстрації 0100U004565), зокрема підтемі № 2 “Створення консорціумів симбіотиків бактеріальних культур пробіотичної дії та розробка адаптаційних продуктів харчування з їх участю”.
Мета і задачі дослідження. Метою роботи є розробка біотехнології отримання гідролітичного ферментного препарату з α-галактозидазною активністю і його використання при переробці соєпродуктів.
Для досягнення зазначеної мети були поставлені такі задачі:
– провести дослідження комплексу фізико-біохімічних і технологічних ознак штамів-продуцентів αгалактозиди і здійснити добір перспективних штамів;
– розробити живильне середовище, яке забезпечить максимальне накопичення біомаси клітин, і розробити умови культивування, що сприятимуть підвищенню врожайності біомаси;
– розробити методи виділення й очищення α-галактозидази;
– визначити властивості ферменту і механізм його дії в реакціях гідролізу олігосахаридів у межах загальної концепції каталітичної дії карбогідраз;
– визначити робочі режими експлуатації ультрафільтраційної мембрани для концентрування ферменту;
– розробити технологічну та апаратурну схеми виробництва ферментного препарату Галактолонгін Г10х;
– вивчити умови ферментативного гідролізу соєпродуктів із застосуванням препарату Галактолон-гін Г10х, провести промислову апробацію, розробити нормативну документацію.
Об’єктами досліджень були: культури лакто- і біфідобактерій, живильні середовища, соєве молоко.
Предмети досліджень – процеси виділення, очищення, концентрування і сушіння ферментного препарату, вплив різних фізико-хімічних чинників на активність ферментного препарату, ідентифікація функціонально каталітичних груп активного центру ферментного препарату, механізм дії ферментного препарату, процес гідролізу соєпродуктів за допомогою одержаного ферментного препарату.
Методи досліджень – фізико-хімічних характеристик ферментного препарату, активності досліджуваного штаму біфідобактерій були традиційні і сучасні мікробіологічні, технологічні і біохімічні методи.
Наукова новизна одержаних результатів. Вивчено динаміку росту культури Bіfіdobacterіum longum на різних живильних середовищах і обрано оптимальне живильне для середовище подальшого культивування даної культури. Обрано оптимальні параметри дезінтеграції клітинної стінки культури B.longum. Проведено очищення ферменту за допомогою різних методів. Експериментально доведено можливість застосування ультрафільтрації для концентрування й очищення культуральної рідини, яка містить культуру B.longum. Вивчено вплив різних фізико-хімічних чинників на активність α-галактозидази. Проведено ідентифікацію каталітично функціональних груп активного центру α-галактозидази. Запропоновано механізм розриву α-1,6-глікозидного зв’язку в галактоолігосахариді рафінозі. Досліджено умови гідролізу соєвих галактоолігосахаридів. Розроблено науково обґрунтовану принципову технологічну схему одержання гідролітичного ферментного препарату Галактолонгін Г10х.
Експериментально доведено можливість промислового виробництва гідролітичного ферментного препарату Галактолонгін Г10х. Наукова новизна роботи підтверджена патентом.
Практичне значення одержаних результатів. Розроблено науково обґрунтовані принципову і апаратурну технологічні схеми одержання гідролітичного ферментного препарату Галактолонгін Г10х. На підставі одержаних даних розроблено нормативну документацію на виробництво гідролітичного ферментного препарату Галактолонгін Г10х. Розроблену технологію апробовано на підприємстві, що виробляє поліпшувачі борошна на основі ферментних композицій СП “ПП Карат”.
Особистий внесок здобувача. Особистий внесок полягає у забезпеченні методичного оформлення роботи, виконанні аналітичної і експериментальної роботи, аналізі та узагальненні одержаних даних у вигляді формування висновків і рекомендацій, підготовці матеріалів досліджень до публікації, розробці нормативно-технічної документації, промислової апробації розробленої технології. Особистий внесок здобувача підтверджується поданими документами і науковими публікаціями.
Апробація результатів дисертації. Результати досліджень повідомлені на Міжнародній конференції “Функціональні продукти харчування” (Кубань, 2001 р.); четвертій Міжнародній науково-технічній конференції “Їжа. Екологія. Людина” (Москва, 2001 р.); першому Міжнародному конгресі “Біотехнологія – стан і перспективи розвитку” (Москва, 2002 р.); четвертому Українському біохімічному з’їзді (Чернівці, 2002 р.); 69-й науковій конференції молодих учених, аспірантів і студентів “Розроблення, дослідження і створення продуктів функціонального харчування, обладнання та нових технологій для харчової і переробної промисловості” (Київ, 2003 р.); 63-й науковій конференції Одеської національної академії харчових технологій (Одеса, 2003 р.).
Публікації. Результати дисертації опубліковані у 12 друкованих працях, включаючи 6 статей, один патент, 5 тез.
Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, чотирьох розділів, висновків, списку літератури і додатків. Зміст роботи викладено на 142 сторінках, включаючи 14 таблиць (на 4 стор.), 31 рисунок (на 4 стор.), 3 додатка (на 17 стор.). Список використаних бібліографічних джерел містить 138 найменувань (на 10 стор.).
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обґрунтовано актуальність теми досліджень, визначено наукову новизну та практичну цінність, сформульовано загальну мету та спрямованість роботи.
У першому розділі на базі аналізу літературних джерел розглянуто питання хімічного складу соєпродуктів та їх значення в харчуванні і профілактиці захворювань.
Розглянуто біотехнологічні засади використання ферментів при переробці рослинної сировини і застосування ферментних препаратів у харчовій промисловості. При переробці рослинної сировини в харчові продукти, корми, енергоносії широко використовується ферментативний гідроліз. При цьому виникають завдання різного ступеня складності, що визначається видом і числом гідролізованих субстратів, їх локалізацією в сировину, агрегатним станом у гідролітичній системі, заданим ступенем розщеплення і складом продуктів гідролізу. Найбільш простими є процеси гідролітичного розщеплення індивідуальних водорозчинних субстратів. З процесів цього типу в технології використовують інверсію сахарози, гідроліз лактози, інших олігосахаридів, глікозидів.
Представлено загальну характеристику ферментів класу гідролаз і характеристику методів виділення ферментів, також представлено характеристику і властивості ферменту αгалактозидази, що гідролізує галактоолігосахариди соєпродуктів.
У біотехнологічних прийомах переробки сої в харчові продукти представлені продукти харчування із сої, що виробляються провідними країнами-виробниками.
У другому розділі викладено відомості про об’єкти і методи досліджень. Подано структурну схему, що відображає основні напрямки досліджень та взаємозв’язок етапів вирішення поставлених задач (рис. 1).
Рис.1. Основні напрямки проведення дослідження
Об’єктами досліджень у даній дисертаційній роботі були: культури біфідобактерій – Bіfіdobacterіum longum ЛМ-6, Bіfіdobacterіum adolescentіs ЛМ-21, Bіfіdobacterіum bіfіdum ЛМ-19, Saccharomyces cerevіsіae ДО-14; живильні середовища — соєва сироватка, кукурудзяно-лактозна, Блаурока, MRS; соєве молоко сухе (ТУ У 6170021.55-99), отримане на Ахтирському сиркомбінаті (Сумська область, Україна).
Основна частина досліджень була проведена в лабораторіях кафедри біохімії і мікробіології ОНАХТ, окремі дослідження виконувалися в лабораторії біохімії СГІ. У дослідженнях використовували як стандартні, так і оригінальні методи із застосуванням сучасних хроматографічних і спектральних методів дослідження.
У третьому розділі наведено результати експериментальних досліджень, пов’язаних з одержанням гідролітичного ферментного препарату з α-галактозидазною активністю, його очищенням, концентруванням, сушінням, впливом різних фізико-хімічних чинників на активність ферментного препарату. Представлено результати ідентифікації каталітично функціональних груп активного центру α-галактозидази, а також механізм дії ферментного препарату і результати гідролізу соєпродуктів з використанням одержаного ферментного препарату.
Як джерело активного ферменту, в роботі використовували чисті культури Bіfіdobacterіum longum, Bіfіdobacterіum adolescentіs, Bіfіdobacterіum bіfіdum із колекції мікроорганізмів кафедри біохімії і мікробіології ОНАХТ.
Рис. 2. Динаміка росту біфідобактерій на живильному середовище MRS:
Культивування біфідобактерій на обраних середовищах показало практично однакову динаміку росту культур з незначним укороченням логарифмічної фази для середовища MRS і більш високі технологічні параметри B.longum на середовищі MRS і на соєвій сироватці. Тому у подальших дослідженнях для одержання αDгалактозидази використовували культуру B.longum.
Аналіз літературних джерел показав, що α-галактозидаза є індуцибельним ферментом, синтез якого здійснюється мікроорганізмами за присутності в живильному середовищі відповідного субстракта-індуктора, а саме специфічних галактоолігосахаридів. Інтенсивність гідролітичних процесів розщеплення галактоолігосахаридів α-галактозидазами пояснюється природою субстрату. Галактоолігосахариди побудовані із залишків галактози. На редукуючому кінці їх молекул знаходиться фруктоза, яка лімітує глибину і швидкість розщеплення галактоолігосахаридів α-галактозидазами, які не можуть розщеплювати α-1,2-глікозидний зв’язок між галактозою і фруктозою.
Соєві боби містять 4,5 %, а сухе соєве молоко 8,5 % галактоолігосахаридів. При ферментації соєвого молока дріжджами відбувається гідроліз α-1,2-глікозидного зв’язку між галактозою і фруктозою β-фруктофуранозидазою (інвертазою), що міститься у дріжджах. Внаслідок цього такі галактоолігосахариди, як рафіноза, стахіоза та інші перетворюються на мелібіозу, галактобіозу, манінотріозу та інші галактоолігосахариди, побудовані тільки із залишків α-D-галактопіраноз, які зв’язані α-1,6-глікозидним зв’язком, доступним для α-галактозидази.
Рис. 3. Вплив індуктора біосинтезу α-галактозидази на активність ферменту
Одержані результати (рис. 3) показують, що при додаванні до живильного середовища MRS ферментованого дріжджами соєвого молока (варіант 4) активність α-галактозидази, синтезованої бактеріями, є найбільшою порівняно з іншими варіантами і контрольним зразком без вуглеводного речовин-індукторів.
Важливе теоретичне і практичне значення при вивченні ферментів мають питання локалізації їх в мікробних клітинах, стабільності й активності ферментних препаратів, їх фізико-хімічної характеристики, можливості і шляхів одержання препаратів різного ступеня чистоти. Ці дослідження передують розробці прикладних аспектів, а також визначенню режимів одержання ферментних препаратів у виробництві.
Із наведених результатів (рис. 4) випливає, що фермент α-галактозидаза є внутрішньоклітинним ферментом, тому для одержання ферментного препарату біомасу, зібрану наприкінці логарифмічної фази росту, центрифугували при 6000 хв.–1 протягом 30 хв., промивали β-меркаптоетанолом, суспендували в цитратному буфері (рН 5,8) і руйнували клітини на дезінтеграторі УЗДН-А. Супернатант використовували як “сирий” ферментний препарат. Найбільш ефективним параметром руйнування клітинних структур, зв’язаних з αDгалактозидазою, обрана тривалість дезінтеграції – 10 хвилин.
Рис. 4. Співвідношення поза-, внутрішньоклітинної і адсорбованої α-галактозидази
Вивчено вплив природи трьох органічних розчинників (ацетону, етанолу, ізопропанолу) та їх концентрації на процес виділення α-галактозидази з культуральної рідини. Визначено, що органічні розчинники при додаванні їх до 1об’єму культуральної рідини 2-х об’ємів збільшують питому активність ферменту від 7,8 од/мг до 13,8 од/мг білка, досягаючи ступеня очищення в 1,3-2,3 рази.
Застосування розчинників (рис. 5) забезпечує збереження активності α-галактозидази на 80-85 %. Велике значення при осадженні ферментів має рН середовище. Найкращі умови для виділення α-галактозидази визначалися незалежно від характеру розчинника при рН 5,8-6,1. Це пов’язано з тим, що найбільш повно ферменти випадають у осад в ізоелектричній точці, коли складаються найбільш сприятливі умови для агрегації белкових молекул.
Рис. 5. Вплив рН культуральної рідини на осадження α-галактозидази
органічними розчинниками
Одержані результати свідчать про те, що при осадженні ферменту етанолом при значенні рН 5,0 активність ферменту у відсотках від вихідної активності наближалася до 90 % порівняно з іншими органічними осаджувачами. Подальше збільшення значень рН не веде до збільшення активності ферменту.
Подальше очищення ферментного препарату здійснювали за допомогою гель-фільтрації на сефадексах.
З наведених результатів (табл. 1) випливає, що внаслідок застосування осадження етанолом і висолювання сульфатом амонію підвищується питома активність з 6,0 од/мг до 82,8 од/мг білка, а ступінь очищення дорівнює при цьому 13,8. Вихід α-галактозидази в цих умовах складає 40,1 %.
При застосуванні гель-хроматографічного поділу на колонках із сефадексами G-25 і G-100 питому активність удалося збільшити на першому етапі до 134 од/мг і на другому – до 422,9 %. Молекулярна маса α-галактозидази склала 112 кДа. Далі очищений препарат з α-галактозидазною активністю розділяли методом електрофорезу в поліакриламідному гелі, що дозволило отримати гомогенний фермент.
Експериментально доведено можливість застосування ультрафільтрації для концентрування і очищення культуральної рідини, що містить культуру Bіfіdobacterіum longum. Для здійснення цього процесу можна рекомендувати напівволоконні мембрани ВПУ1500 у складі розділових модулів АР або їм подібні. Робочі параметри ультрафільтрації рекомендуються наступні: Р=1 атм, t=40 °С при максимально можливій для даної конструкції апарата швидкості потоку рідини у міжмембранному каналі. Даним способом вдається досягти фактора концентрування 5-5,5.
Таблиця 1
Очищення α-галактозидази
З метою одержання готової форми технічного препарату одержаний після дезінтеграції і центрифугування фільтрат культуральної рідини необхідно піддати концентруванню. Найчастіше для даної мети в технології ферментних препаратів використовують методи вакуум-випарювання. Його також використовують як один з етапів отримання сухих технічних або очищених ферментних препаратів. Даний процес здійснювали на роторному випарному апараті фірми “LUVA” при температурі, що дорівнює 32 °С.
Отриманий внаслідок осадження етанолом осад ферменту піддавали висушуванню. Метою сушіння було також одержати стабільний при зберіганні ферментний препарат із концентрату культуральної рідини. Для стабілізації активності ферменту при сушінні використовували MnCl2 різної концентрації. Оптимальна концентрація стабілізатора становила 0,06 % і забезпечувала збереження при сушінні 94 % активності ферменту. Сушіння ферменту здійснювали у вакуум-сушильній шафі при таких параметрах: концентрація стабілізатора 0,06 %; Т=35°С; Рост.=125 Па; τ=10 год.
Досліджували вплив температури і рН та рН-стабільності на каталітичну активність αDгалактозидази. α-D-галактозидаза, продукована B.longum, проявляла активність у діапазоні значень pН від 5,0 до 7,5, досягаючи максимуму при pН 6,0. Досліджували температурний інтервал для прояву максимальної α-галактозидазної активності і термічну стійкість ферментного препарату. Температурний інтервал для прояву максимальної αDгалактозидазної активності ферменту досить широкий – від 33 до 48 °С, але при більш високій температурі настає його інактивація. Одержані експериментальні дані свідчать про досить високу термічну стійкість α-галактозидази досліджуваного штаму біфідобактерій. Значна інактивація має місце лише при температурі 60 °С і вище.
Проводили ідентифікацію каталітично функціональних груп активного центра α-галактозидази. Визначили наявність карбоксильної та імідазольної груп в активному центрі α-галактозидази.
Для підтвердження участі карбоксильних та імідазольних груп, що беруть участь у розриві α-1,6-глікозидних зв’язків у рафінозі, розраховували теплоти іонізації цих груп (ΔН) за рівнянням Вант-Гоффа.
Обчислені значення величин рК та ΔН наведено у табл. 2.
Таблиця 2
Показники констант і теплот іонізації
Як випливає із даних таблиці, значення ΔН відповідають карбоксильним та імідазольним групам, що є важливим критерієм ідентифікації функціональних груп активного центра ферменту. Наявність імідазольної групи в каталітичному центрі ферменту досліджували специфічною реакцією на цю групу – реакцією фотоокислювання у присутності фотосенсибілізатора метиленового синього. Експериментальні дані показали, що α-галактозидаза піддавалася інтенсивній інактивації при фотоокисленні з метиленовим синім, тоді як у контрольних дослідах її активність залишалася сталою.
У розумінні механізму розщеплення глікозидних зв’язків карбогідразами виходили з принципу орієнтованої сполученої атаки електрофільних та нуклеофільних груп на глікозидний зв’язок оліго- і полісахаридів.
Досліджено умови гідролізу соєвих галактоолігосахаридів. Показано, що повний їх гідроліз α-галактозидазою B.longum досягається за 30–40 хв. ферментолізу при активності 9–10 од/мг, при рН 6,0 і температурі 45 °С.
У четвертому розділі наведено принципову технологічну схему виробництва гідролітичного ферментного препарату Галактолонгін Г10х, опис технологічних процесів, дані щодо виробничої апробації.
З використанням експериментальних даних розроблено принципову технологічну схему виробництва гідролітичного ферментного препарату Галактолонгін Г10х.
| 
