|
ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ім. В.Н. КАРАЗІНА
ГЛИБИЦЬКИЙ Геннадій Марксович
УДК: 577:621.3.029.65
ФІЗИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ БІОМОЛЕКУЛ У РОЗЧИНАХ
ЗА ДАНИМИ НВЧ-ДІЕЛЕКТРОМЕТРІЇ
03.00.02 – біофізика
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата фізико-математичних наук
Харків - 2000
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України.
Науковий керівник
доктор физико-математичних наук, професор Малеєв Володимир Якович, Інститут радіофізики та електроніки ім. О.Я. Усикова НАН України, завідувач відділу.
Офіційні опоненти:
-доктор фізико-математичних наук, професор Казанський Вадим Борисович, Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна, професор;
-доктор фізико-математичних наук, професор Харкянен Валерій Миколайович, Інститут фізики НАН України, завідувач відділу
(м. Київ).
Провідна установа
Фізико-технічний інститут низьких температур ім. Б.І. Вєркіна НАН України, відділ молекулярної біофізики, м. Харків.
Захист відбудеться 28.11.2000 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.051.13 у Харківському національному університеті ім. В.Н. Каразіна, 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4, ауд.7-4.
З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім.В.Н.Каразіна за адресою: 61077, м. Харків, пл. Свободи, 4.
Автореферат розісланий 26.10.2000 року
Вчений секретар
спеціалізованої вченої ради Гаташ С.В.
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
Актуальність теми. Діелектрометрія в надвисокочастотному (НВЧ) діапазоні дозволяє одержати інформацію про стан води в біологічних системах, про конформацію макромолекул та їх гідратацію. Гідратні оболонки біополімерів визначають їх стабільність, структуру та динаміку й відповідають за поглинання більшої частини енергії НВЧ випромінювання. Діапазон міліметрових довжин хвиль є найбільш інформативним для вивчення ступеня гідратації біомолекул та їх взаємодії з електромагнітним полем НВЧ, а одним з основних методів дослідження є метод діелектрометрії. Результатом вимірювань, в загальному випадку, є залежність комплексної діелектричної проникності від частоти, яка характеризує значення втрат і час релаксацій (властиві речовині). З індивідуальних внесків у діелектричний спектр може бути отримана специфічна інформація про структуру гідратної оболонки.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Результати дисертаційної роботи було одержано в межах виконання планових науково-дослідних робіт за темами: “Кварк”, реєстраційний № 81.093.675, постанова Президії АН УРСР № 604 від 25.12.80; “Кварк-2”, реєстраційний № 01.86.0086548, постанова Президії АН УРСР № 474 від 27.12.85; “Кор”, реєстраційний № 01.92 и 027978, постанова Бюро ВФА АН УРСР від 11.12.1991, протокол №10; “Гран”, № 01.96 006110, постанова Бюро ВФА НАН України від 19.12.95, протокол №9.
Мета і задачі дослідження. Метою дослідження було визначення фізичних властивостей біомолекул (ДНК, білка й малих молекул) у розчинах в широкому інтервалі температур на основі аналізу комплексної діелектричної проникності розчинів у надвисокочастотному діапазоні довжин хвиль.
Для досягнення цієї мети були поставлені та вирішені наступні задачі:
1. Розробка НВЧ - діелектрометра на основі методу змінної товщини в сантиметровому діапазоні довжин хвиль.
2. Визначення поглинання електромагнітних хвиль молекулами ДНК та її фрагментів у сантиметровому діапазоні довжин хвиль.
3. Розробка методу вимірювання діелектричних параметрів водних розчинів біомолекул у міліметровому діапазоні довжин хвиль при температурах 30-70°С.
4. Визначення гідратації молекул білка в розчині на прикладі сироваткового альбуміну людини (САЛ) в інтервалі температур 30-60°С.
5. Визначення комплексної діелектричної проникності водних розчинів малих біомолекул (гліцину, сахарози) в інтервалі температур 30-60°С.
Об'єкт дослідження - біомолекули у водних розчинах.
Предмет дослідження - діелектрична проникність розчинів біомолекул та їх гідратація в інтервалі температур 30-60°С.
Методи дослідження - діелектрометрія в надвисокочастотному діапазоні довжин хвиль, ультрафіолетова спектроскопія, гель-електрофорез, віскозіметрія.
Наукова новизна одержаних результатів.
1. Розроблено методику вимірювання комплексної діелектричної проникності розчинів з великими втратами при температурах 20-70°С.
2. В однохвильовому наближенні одержано математичне обгрунтування хвилеводного методу вимірювання комплексної діелектричної проникності із застосуванням герметизованої кювети.
3. Вперше одержано значення комплексної діелектричної проникності в міліметровому діапазоні довжин хвиль розчинів сироваткового альбуміну при концентраціях 10%, 15% і розчинів сахарози при концентраціях 10%, 20% в інтервалі температур 30-60°С та розчинів гліцину при концентрації 20% в інтервалі температур 20-70°С.
4. Встановлено, що гідратація молекул білка знижується при збільшенні температури.
Практичне значення одержаних результатів. Методика вимірювання комплексної діелектричної проникності розчинів з великими втратами дозволяє одержувати дані при температурах 20-70°С. Математичне обгрунтування хвилеводного методу вимірювання може бути застосовано для розрахунків параметрів НВЧ сигналу при використанні герметизованих кювет.
Експериментальні дані про відсутність надлишкового поглинання розчинів нативної та фрагментованої ДНК, закономірності в зміні гідратних властивостей САЛ і діелектричні параметри розчинів сахарози і гліцину у широкому інтервалі температур можуть бути використані при з'ясуванні молекулярних механізмів взаємодії електромагнітних полів міліметрового діапазону з біологічними об'єктами.
Особистий внесок здобувача. В опублікованих із співавторами наукових працях особистий внесок здобувача полягає:
у роботах [1,9] - в участі в постановці біофізичного експерименту, одержанні експериментальних даних, їхньому аналізі; розробці і створенні вимірювального пристрою і вимірюванні коефіцієнта поглинання.
у роботах [2,10] - у розробці схеми діелектрометра, аналізі літературних даних, a також проведенні вимірювань;
у роботі [3] - у постановці експерименту, аналізі літературних даних, розробці змішувача і генератора, одержанні і аналізі експериментальних даних;
у роботі [8] - у розробці способу вимірювання проникності без застосування рухливих елементів пристрою;
у роботі [11,12] - у постановці експерименту, проведенні вимірювань і аналізі отриманих результатів.
Апробація результатів дисертації. Основні результати дисертаційної роботи були представлені й обговорені на: V конференції з спектроскопії біополімерів (Харків, 1984), Vl конференції з спектроскопії біополімерів (Харків, 1988), International Conference on Millimeter and Submillimeter Waves and Application (San-Diego, USA, 1994), International symposium "Physics and Engineering of Millimeter and Submillimeter Waves", (Kharkov, Inst. of Radiophysics and Electronics of National Academy of Sciences of Ukraine, 1994), семінарі Харківського відділення Українського біофізичного товариства (2000).
Публікації. Результати дисертації опубліковані у 13 наукових працях, в тому числі у 7 статтях, 1 авторському свідоцтві, у 5 матеріалах і тезах доповідей національних і міжнародних конференцій і симпозіумів.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, 3 розділів і висновків. Повний обсяг дисертації складає 106 с., містить 21 рисунок і 17 таблиць. Список використаних літературних джерел - 138 найменувань.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
У вступі обгрунтовано актуальність теми дисертації, сформульовано мета та перелічені задачі, які необхідно вирішити для їх досягнення, вказано новизна та практичне значення, наведено дані про апробацію дисертаційної роботи.
У розділі 1 дисертації проведено аналіз літературних даних про сучасні уявлення щодо взаємодії електромагнітних хвиль НВЧ діапазону з біологічними об'єктами та про дослідження гідратації біомолекул у розчинах. Відзначається, що у зв'язку з високою насиченістю середовища штучно створеними електромагнітними полями уявляються важливими дослідження, в яких розкриваються механізми взаємодії мікрохвиль з біооб'єктами. Проаналізовано результати досліджень взаємодії біополімерів з електромагнітним випромінюванням НВЧ діапазону в широкому діапазоні довжин хвиль - від сантиметрових до субміліметрових. Представлено теоретичні положення, що пояснюють природу взаємодій: як у білках, так і в ДНК теорія передбачає можливість існування коливань, що виявляються в мікрохвильовому діапазоні довжин хвиль. Так, розвинуті моделі дозволяють розраховувати частоти, що знаходяться в міліметровому діапазоні довжин хвиль і відповідають міждоменним рухам білка. Можливість існування у ДНК коливань субміліметрового діапазону довжин хвиль засновується на припущенні існування далеких кооперативних зв'язків.
Проведено аналіз різних схем діелектрометричних вимірювальних пристроїв і відповідних моделей, що використовуються при розрахунках проникності. Показано, що інтерпретація даних діелектричного методу дослідження значно спрощується у випадку вивчення властивостей тих самих зразків на різних частотах. Отримані таким чином дані фіксують спектральні компоненти речовини у розчині, що необхідно для повного аналізу процесів релаксації в зразку. На основі порівняння існуючих на цей час підходів до отримання даних про фізичні властивості біомолекул у розчинах зроблено висновок про перспективність застосування методу діелектрометрії для визначення поглинання розчинів та гідратації біомолекул.
У розділі 2 представлено методичні підходи, що були використані у дослідах розчинів біомолекул методом діелектрометрії.
Особливості розповсюдження електромагнітних хвиль у вимірювальному пристрої характеризуються наявністю відбиття хвиль в декількох шарах, якими є герметизуючі пластини, шар з рідиною та повітрям. Для з'ясування фізичних процесів, що відбуваються у вимірювальній кюветі під час експерименту, була розроблена еквівалентна схема кювети.
Базовим припущенням моделі є уявлення дифракційного поля в проміжку між торцями вхідного та вихідного хвилеводів ділянкою плоскої хвилі, злегка розмитої на кінцях, що розповсюджується в межах циліндра з діаметром, який дорівнює внутрішньому діаметру хвилевода. Тому з'єднання декількох хвилеводних відрізків круглого поперечного перетину, котрі відрізняються значеннями комплексної діелектричної постійної розчину, що їх заповнює, при малих розмірах шару з розчином d можна розглядати як спрощену модель, що описує процес поширення потужності в пристрої. Еквівалентна схема кювети зображена на рис. 1.
Вираз амплітуди хвилі А5, що пройшла крізь систему шарів, через амплітуду А1, має вигляд:
А5=А1(1+V4)C12C23C34, (1)
або в загальному випадку
j=n-1
An=А1(1+Vn-1)ХCj, j+1, (2)
j=1
де
Cj, j+1=exp(ihj+1dj,j+1)(1+Vj)/(1+Vj+1exp(2ihj+1dj,j+1)), (3)
hj - константа розповсюдження, Vj - коефіцієнт відбиття.
Рис. 1. Еквівалентна схема кювети.
Відповідно до методу змінної товщини необхідно визначити відношення інтенсивностей сигналів при двох величинах шарів розчину (d0 и d0 +Dd ) і набіг фаз:
WM=((Re(A5(d0)))2+(Im(A5(d0)))2)/((Re(A5(d0+Dd)))2+(Im(A5(d0+Dd)))2), (4)
QM=arctg(Im(A5(d0+Dd))/Re(A5(d0+Dd)))-
-arctg(Im(A5(d0+Dd))/Re(A5(d0+Dd))). (5)
Відношення інтенсивностей сигналів WМ, WЕ (функція поглинання НВЧ потужності в розчині) і різниця аргументів QM, QE (функції фазового зсуву НВЧ-хвилі на довжині Dd) є незалежними величинами (позначки М, Е визначають величини, розраховані за моделлю й визначені в експерименті).
В процесі визначення величин eў і eІ розчину вирішуються наступні задачі:
1) пряма задача - знаходження констант КW, КQ при вимірюванні речовин з відомими eў, eІ; при цьому вирішуються рівняння
WM(d0,Dd,eў,eІ)-KWWE(d0,Dd)=0, (6)
QM(d0,Dd,eў,eІ)-KQQE(d0,Dd)=0; (7)
2) обернена задача - за значеннями WE і QE (для розчинів з невідомими eў, eІ) із отриманих раніш залежностей КW=f(WE) і КQ=f(QE) визначаються відповідні значення констант і при вирішенні системи (6-7) розраховуються величини eў, eІ.
У роботі вивчалися: розчини ДНК з концентрацією 5 мг/мл, виділеної з Е. coli, розчини ДНК з концентрацією 6 мг/мл з еритроцитів курчат (препарат фірми “Reanal”), розчини сироваткового альбуміну людини з концентрацією 10% та 15% (препарат фірми “Reanal”), розчини сахарози з концентрацією 10% та 20% (“Реахим”, чда), розчини гліцину з концентрацією 20% (препарат фірми “Reanal”).
Для вимірювання комплексної діелектричної проникності було розроблено відповідні пристрої. Пристрій для вимірювання проникності розчинів у сантиметровому діапазоні довжин хвиль методом змінної товщини містить: генератор НВЧ, направлені відгалужувачі, хвилемір, атенюатор, допоміжний детектор НВЧ, цифрові вольтметри, феритовий вентиль, підсилювач, вимірювальну секцію.
Для дослідження властивостей рідин у міліметровому діапазоні довжин хвиль при підвищених температурах був розроблений діелектрометр, який містить: НВЧ генератор, феритові вентилі й направлені відгалужувачі, вимірювальні атенюатор та фазообертач, вимірювальну кювету.
Коефіцієнт поглинання визначається при закритому каналі порівняння виміром продетектованих сигналів J1 і J2, що відповідають двом товщинам розчину Х1 і Х2:
a = (ln(J2/J1))/2(X2-X1). (8)
Фазова постійна вимірюється звичайним мостовим методом, тобто визначаються показання фазообертача j1 і j2 для відповідних довжин шару речовини Х1 і Х2 при встановленні нульового балансу на детекторі:
b = (j1-j2)/(Х1-Х2). (9)
За значеннями a і b легко обчислити дійсну eў і уявну eІ частини комплексної діелектричної проникності для довільної довжини хвилі:
eў = l/lкр + (l/2p)2(b2 - a2), (10)
eІ = 2(l/2p)2ab, (11)
де l - довжина хвилі у вільному просторі, lкр - критична довжина хвилі.
Для забезпечення стабільності геометричних параметрів при перезавантаженні розчинів, було розроблено діелектрометр з кюветою, яка не потребує розбирання при перезавантаженні. Крім того, для підвищення чутливості було застосовано супергетеродинну систему реєстрації сигналу. Діелектрометр містить генератор та гетеродин, виконані на діодах Ганна, які випромінюють НВЧ сигнал на частотах 44.0 і 44.05 ГГц відповідно. Вимірювання поглинання і фазового зсуву сигналу у кюветі проводилися за допомогою каліброваних вимірювального атенюатора і фазообертача. Смуги пропускання підсилювача і селективного мікровольтметра СМВ складають відповідно 10 МГц і 1 кГц, чутливість описаної схеми не менше 115 дБ.
У розділі 3 наведено результати досліджень властивостей розчинів молекул за даними НВЧ-діелектрометрії.
Дослідження поглинання розчинами ДНК НВЧ випромінювання в діапазоні 9-12 ГГц було проведено для перевірки теоретичних уяв і експериментальних результатів інших авторів. Зразками для досліджень були:
1. Розчин високомолекулярної ДНК, виділеної з E. coli.
2. Розчин низькополімерної ДНК з еритроцитів курчат, а також її фрагментів, які були отримані після обробки розчину ультразвуком.
3. Розчин фрагментів ДНК з E. coli, що були отримані ферментативним гідролізом.
За низькополімерний зразок було взято препарат фірми “Reanal” - еритроцитарну ДНК. Вимірювання було виконано також з розчинами, що містять фрагментовані двома методами молекули ДНК - ультразвуковим опроміненням і гідролізом за допомогою ферменту дезоксирибонуклеази. Значення концентрації ферменту складало 0.1 мг/мл; час опромінення ультразвуковими хвилями і частота складали 80 хвилин і 22 кГц, відповідно.
Аналогічна серія зразків була підготовлена з ДНК, виділеної з E. coli. Для контролю величини довжин фрагментів ДНК, отриманих як опроміненням ультразвуком, так і розщепленням ДНКазой, фрагменти ДНК аналізувалися за допомогою гель-электрофорезу.
Контрольні вимірювання в діапазоні 9-12 ГГц параметрів води і розчинів солей показали, що значення абсолютних коефіцієнтів поглинання відрізняються від значень, відомих за літературними даними, не більш як на 3%.
Результати вимірювань подано в табл.1. Відносні коефіцієнти поглинання для розчинів нативної (РўN) і опроміненої ультразвуком (Руз) ДНК із еритроцитів курчат (з концентрацією 5 мг/мл) близькі до одиниці, як і величини середніх значень коефіцієнтів Рўф той самой ДНК з концентрацією 6 мг/мл, але фрагментованої ферментом ДНКазой. Для аналогічних розчинів ДНК з E. coli з концентрацією 5 мг/мл відповідні коефіцієнти поглинання для нативної ДНК (РІN) і ДНК, фрагментованої ДНКазой (РІф1), також не відрізняються від одиниці.
Таблиця 1.
Відносні коефіцієнти поглинання розчинів нативної та фрагментованої ДНК у діапазоні 9-12 ГГц.
F, ГГц РўN РІN Р уз Рўф РІф1 РІф2
8.81 0.99±0.01 1.02±0.01 0.98±0.01 1.01±0.01 1.01±0.01 1.00±0.01
9.41 0.99±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01 1.01±0.01 1.00±0.01
9.81 0.99±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01 1.01±0.01 1.00±0.01
10.08 - 1.00±0.01 - 0.99±0.01 1.01±0.01 1.01±0.01
10.24 1.00±0.01 - 0.99±0.01 - - 1.01±0.01
10.90 0.99±0.01 - 0.99±0.01 - - 1.00±0.01
11.26 0.99±0.01 - 0.99±0.01 - - 1.01±0.01
Отримані дані також не дозволяють зробити висновок про зміну поглинання під час дії ферменту: відносні коефіцієнти поглинання розчину ДНК в залежності від часу дії ДНКази практично не відрізняються від одиниці. У зв'язку з тим, що зменшення в'язкості розчину спостерігалося практично відразу після розчинення ферменту, контроль за розміром сигналу виконувався в перші секунди і хвилини після введення ферменту. Навіть невелика зміна коефіцієнта поглинання (на декілька відсотків) повинна була б привести до помітної зміни значення вихідного сигналу; однак такого ефекту зареєстровано не було. Таким чином, дослідження показало відсутність поглинання НВЧ випромінювання високополімерною ДНК з E. coli і коротких фрагментів цієї ж ДНК, а також низькомолекулярної ДНК.
Інша група результатів має відношення до дослідження зміни ступенів гідратації зі зміною температури. Дані вимірювань діелектричних характеристик 10% і 15% розчинів сироваткового альбуміну людини (САЛ) подано в табл. 2 і табл. 3. З таблиць видно, що поглинання і фазовий зсув зменшуються, коли температура розчину підвищується.
Таблиця 2.
Діелектричні характеристики 10% розчину САЛ.
Т,°C a, неп/мм b, рад/мм eў eІ
23 2.11±0.06 4.0±0.2 16.9±2.3 24.6±1.4
30 2.13±0.06 4.2±0.2 19.6±2.4 26.3±1.5
40 2.13±0.06 4.6±0.2 23.9±2.7 28.3±1.5
47 2.08±0.06 4.7±0.2 26.5±2.7 28.6±1.5
53 2.00±0.06 4.9±0.2 28.6±2.8 28.3±1.5
60 1.91±0.06 5.0±0.2 31.3±2.5 27.7±1.4
Таблиця 3.
Діелектричні характеристики 15% розчину САЛ.
Т,°C a, неп/мм b, рад/мм eў eІ
23 1.97±0.06 4.0±0.2 17.7±2.3 22.8±1.3
30 1.98±0.06 4.1±0.2 19.2±2.4 23.6±1.3
40 1.98±0.06 4.4±0.2 23.1±2.6 25.5±1.4
50 1.92±0.06 4.7±0.2 26.9±2.7 26.2±1.4
60 1.76±0.06 4.8±0.2 30.2±2.8 24.9±1.3
65 1.67±0.06 4.8±0.2 30.3±2.8 23.5±1.3
| 
