Электронная библиотека Веда
Цели библиотеки
Скачать бесплатно
Доставка литературы
Доставка диссертаций
Размещение литературы
Контактные данные
Я ищу:
Библиотечный каталог российских и украинских диссертаций

Вы находитесь:
Диссертационные работы России
Биологические науки
Биофизика

Диссертационная работа:

Трофимова Ольга Дмитриевна. Исследование молекулярного механизма реакции ферментативного гидролиза триглицеридов : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.02 : Воронеж, 2004 156 c. РГБ ОД, 61:04-3/1144

смотреть содержание
смотреть введение
смотреть литературу
Содержание к работе:

ВВЕДЕНИЕ 4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Современные представления о липолитических ферментах 9

1.1. Характеристика продуцентов и физико-химические свойства липаз 9

1.2. Особенности структуры и механизма действия эстераз 13

1.3. Значение липолитических ферментов в природе и хозяйственной деятельности человека 21

ГЛАВА 2. Современные аспекты иммобилизации липолитических фер

ментов 25

2.1. Методы иммобилизации липаз 25

2.2. Физико-химические аспекты катализа иммобилизованными ферментами 32

2.3. Применение иммобилизованных липаз в промышленности, медицине, аналитических целях 37

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования 40

3.1. Объект исследования 40

3.2. Методы исследования 40

3.2.1. Выделение препарата липазы из микромицета Rhizopus japonicus

1403 40

3.2.2. Очистка и определение молекулярной массы липазы методом гель-хроматографии 41

3.2.3. Ионообменная хроматография на колонке с диэтиламиноэтил-целлюлозой (ДЭАЭ-целлюлозой) 42

3.2.4. Определение содержания белка в препарате методом Лоури 43

3.2.5. Определение содержания белка в иммобилизованных ферментых препаратах модифицированным методом Лоури 44

3.2.6. Спектрофотометрический метод определения каталитической активности липазы 45

3.2.7. Подготовка ионитов АВ-26 и АВ-17-2П к иммобилизации 46

3.2.8. Методика сорбционной иммобилизации липазы 47

3.2.9. Методика ковалентной иммобилизации липазы с помощью

глутарового альдегида 48

3.2.10. Подготовка исследуемых образцов к анализу методом ИК-

спектрофотометрии (ИКС) 48

3.2.11 Аналитический электрофорез белков в полиакриламидном геле 51

3.2.12. Метод визуализации пространственной структуры белковых

молекул на базе программы MolScript 52

3.2.13. Фотоокисление белков в присутствии метиленового голубого 53

3.2.14. Статистическая обработка результатов экспериментов 54 ГЛАВА 4. Вьщеление, очистка, физико-химические свойства препарата

липазы из Rhizopus j aponicus 1403 55

4.1. Изучение условий выделения и очистки липазы из Rhizopus j aponicus 1403 55

4.2. Физико-химические свойства липазы из Rhizopus j aponicus 1403 64

ГЛАВА 5. Исследование особенностей строения активного центра ли

пазы Rhizopus japonicus 68

5.1. Идентификация имидазольной группы гистидина в каталитическом

центре молекулы липазы Rhizopus japonicus 68

5.2. Воздействие фенилметилсульфонилфторида на функциональные свойства и вторичную структуру липазы 74

5.3. Воздействие дициклогексилкарбодииимида на функциональные свойства и вторичную структуру липазы 79

5.4. Исследование роли ионов двухвалентных металлов в функционировании липазы Rhizopus j aponicus 82

ГЛАВА 6. Изучение особенностей четвертичной структуры липазы

Rhizopus j aponicus 1403 88

6.1. Воздействие додецилсульфоната натрия на состояние четвертичной структуры липазы 88

6.2. Исследование особенностей вторичной структуры субъединиц липазы методом ИК-спектрофотометрии 92

6.3. Модификация липазы бифункциональными реагентами 95

6.4. Визуализация олигомерной структуры липазы Rhizopus j aponicus 1403 методом атомно-силовой микроскопии 96

Глава 7. Ковалентная иммобилизация липазы из Rhizopus japonicus

1403 на анионите АВ-17-2П модифицированным глутаральдегидным мето

дом 101

7.1. Исследование условий иммобилизации липазы на некоторых ионо

обменных смолах 101

7.2. Некоторые физико-химические и кинетико-термодинамические

аспекты катализа свободной и иммобилизованной липазой 106

7.3. Исследование технологических характеристик реакции гидролиза

триглицеридов липазой, иммобилизованной на анионите АВ-17-2П 114

ГЛАВА 8. О молекулярном механизме реакции ферментативного

гидролиза триглицеридов 118

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 130

ВЫВОДЫ 134

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 136 

Введение к работе:

Актуальность проблемы. В последние годы при усовершенствовании многих технологических процессов широко используются гидролитические ферменты микроорганизмов, характеризующиеся более высокой активностью и низкой себестоимостью по сравнению с гидролазами растительного и животного происхождения. Выявление особенностей структуры и функционирования липолитичеких ферментов становится особенно актуальным в связи с их биологической ролью, а также предоставляет новые возможности: для создания катализаторов с целью их дальнейшего эффективного применения в различных отраслях промышленности и в качестве медицинских препаратов.

В настоящее время в лабораториях научно-исследовательских институтов разрабатывается новая прогрессивная технология — катализ с использованием иммобилизованных ферментов, которые имеют ряд преимуществ перед растворимыми катализаторами в связи с более высокой стабильностью по отношению к денатурирующим факторам окружающей среды. Кроме того, подбирая соответствующий носитель и способ связывания, можно значительно уменьшить неблагоприятное воздействие матрицы носителя на структуру белка и повысить тем самым его ценность как биокатализатора.

Возрастающие масштабы использования липаз в биотехнологии вызывают необходимость поиска эффективных продуцентов ферментов данной группы, в качестве которого в настоящей работе предложен микромицет Rhizopus japonicus 1403. Для решения проблем регулирования биологических свойств липазы необходимо детальное исследование физико-химических, кинетико-термодинамических свойств фермента, особенностей его структурной организации, раскрытие молекулярного механизма реакции превращения субстрата.

Выполненная работа проведена в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского госуни верситета, входящей в координационный план научно-исследовательских работ РАН.

Цели и задачи исследования. Целью данной работы является изучение молекулярного механизма реакции гидролиза сложноэфирной связи в молекуле триглицеридов липазой Rhizopus japonicus 1403.

В этой связи в работе были поставлены следующие задачи:

? разработка эффективной методики выделения и очистки липазы из микромицета Rhizopus japonicus 1403;

? идентификация функциональных групп каталитического и субстрат-связывающего центров в молекуле липазы;

? исследование особенностей надмолекулярной организации изучаемого фермента методами гель-хроматографии, электрофореза и атомно-силовой микроскопии;

? создание гетерогенного биокатализатора на основе липазы, иммобилизованной модифицированным глутаральдегидным способом на отработанном в условиях сахаро-рафинадного производства анионите АВ-17-2П;

? изучение физико-химических и кинетико-термодинамических аспектов гидролиза триглицеридов свободной и иммобилизованной липазой;

? выявление оптимальных технологических режимов функционирования полученного иммобилизованного препарата фермента в реакторах периодического и непрерывного действия;

• описание молекулярного механизма разрыва сложноэфирных связей в

молекуле триглицеридов. Научная новизна.

разработан эффективный метод получения гомогенного препарата липазы Rhizopus japonicus 1403 с высокой степенью очистки;

? впервые четвертичная структура обнаружена у липолитического фермента семейства Mucoraceae, выявлены физико-химические свойства и природа взаимодействия субъединиц;

создан новый гетерогенный биологический катализатор на основе липазы, иммобилизованной на отработанном в сахаро-рафинадном производстве анионите АВ-17-2П модифицированным глутаральдегид-ным методом;

•по результатам исследования кинетико-термо динамических и технологических характеристик свободной и иммобилизованной липазы сконструирован реактор непрерывного действия, позволяющий осуществлять гидролиз триглицеридов с высоким выходом;

? изучено строение активного центра липазы Rhizopus japonicus 1403 методами Диксона, химической модификации специфическими реагентами и фотоокислением в присутствии метиленового голубого;

? на основании экспериментальных данных и при использовании программы MolScript описан молекулярный механизм реакции гидролиза сложноэфирной связи в молекуле триглицеридов липазой Rhizopus japonicus 1403

Практическая значимость Получен гомогенный препарат липазы Rhizopus japonicus 1403 с высокой гидролитической активностью. Изучение особенностей надмолекулярной организации липазы позволяет расширить представления о механизмах регуляции функциональных свойств ферментов in vivo. Создан гетерогенный биокатализатор с ковалентно иммобилизованной на отработанном анионите АВ-17-2П липазой, выявлены оптимальные условия его функционирования. Разработанные технологические режимы работы реактора непрерывного действия с полученным гетерогенным катализатором позволяют рекомендовать его для применения в промышленных масштабах. Результаты исследования строения активного центра липазы Rhizopus japonicus 1403 и молекулярного механизма каталитического гидро лиза сложноэфирных связей расширяют и углубляют представления о закономерностях функционировании эстераз семейства Mucoraceae.

Апробация работы. Основные результаты исследований по теме диссертации были представлены на IV Международном симпозиуме «Новые нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2001); XVIII съезда физиологического общества имени И.П. Павлова (Казань, 2001); Международной конференции молодых ученых «Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок, экологически безопасные технологии» (Тверь, 2001); Международной научно-практической конференции «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров и услуг» (Орел, 2001); Международной научно-практической конференции «Пищевые продукты XXI века» (Москва, 2001); Межрегион, конференции молодых ученых «Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов» (Воронеж, 2001); Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы хроматографии» (Москва, 2002); Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003); III Международном Симпозиуме «100 лет хроматографии» (Москва, 2003); II Московском Международном Конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2003); Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматогра-фические приборы» (Москва, 2004), конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2004), III Съезде биофизиков России (Воро-неж, 2004), 8 Conference of International Union of Biochemistry and Molecular Biology (Boston, USA, 2004).

Публикации. По теме диссертационной работы имеется 20 публикаций: 9 статей и 11 тезисов.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Нативная молекула липазы из Rhizopus japonicus 1403 функционирует в виде димера, образованного в результате гидрофобных взаимодействий между двумя субъединицами фермента, находящимися в «открытой» кон-формации.

т

2. Разработан модифицированный метод ковалентной иммобилизации липазы на отработанном в условиях сахаро-рафинадного производства анио-ните АВ-17-2П, полученный препарат является эффективным биокатализатором и может быть рекомендован для применения в промышленной технологии.

3. Функционально значимые аминокислотные остатки субстратсвязы-вающего, каталитического центров и их микроокружения для липаз рода Rhizopus являются идентичными и входят в состав консервативных участков первичных структур гидролаз данной группы.

4. Схема молекулярного механизма расщепления сложноэфирных связей в молекуле триглицеридов.

Структура и объем работы.

Диссертационная работа включает 156 страниц машинописного текста; состоит из Введения, 8 глав, Заключения, Выводов, Списка литературы (177 источников) и Приложения. Иллюстрационный материал включает 36 рисунков, 19 таблиц; в Приложении 9 таблиц.

Подобные работы
Таха Абдул Саттар
Исследование физико-химических свойств и кинетико-термодинамических аспектов реакции гидролиза инулина свободной и иммобилизованной инулиназой
Болотина Виктория Марковна
Исследование механизмов блокирования натриевых каналов мембраны нервного волокна биологически активными веществами
Рындина Наталья Ивановна
Исследование механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и разработка способов его предотвращения
Волков Евгений Израилевич
Исследование механизмов генерации ритмов в системах взаимодействующих биологических и физических осцилляторов
Кондратьев Максим Сергеевич
Исследование механизма организации спиральной структуры олигопептидов
Большаков Алексей Петрович
Исследование механизмов митохондриальной деполяризации и кальциевой дизрегуляции, индуцируемой возбуждающим медиатором глутаматом в нейронах мозга
Пшежецкий Дмитрий Валерьевич
Исследование механизмов влияния Na/K-АТФазы на регуляцию экспрессии генов и развитие клеточной смерти
Бершицкий Сергей Юрьевич
Исследование механизма генерации силы в мышце
Искусных Анна Юрьевна
Исследование механизмов окислительно-восстановительного гомеостаза на примере системы "активированные нейтрофилы-пероксидное окисление липидов-антиоксиданты"
Могилевская Екатерина Александровна
Теоретическое исследование механизмов функционирования и регуляции цикла Кребса митохондрии и Escherichia coli

© Научная электронная библиотека «Веда», 2003-2013.
info@lib.ua-ru.net