Электронная библиотека Веда
Цели библиотеки
Скачать бесплатно
Доставка литературы
Доставка диссертаций
Размещение литературы
Контактные данные
Я ищу:
Библиотечный каталог российских и украинских диссертаций

Вы находитесь:
Диссертационные работы России
Биологические науки
Биофизика

Диссертационная работа:

Пшежецкий Дмитрий Валерьевич. Исследование механизмов влияния Na/K-АТФазы на регуляцию экспрессии генов и развитие клеточной смерти : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.02 : Москва, 2004 133 c. РГБ ОД, 61:04-3/1060

смотреть содержание
смотреть введение
Содержание к работе:

ВВЕДЕНИЕ 4

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ - 9

1.1. Na/K-АТФаза: молекулярная структура, механизм функционирования и регуляция 9

  1. Основные кинетические характеристики Na/K-АТФазы 9

  2. Состав и изоформы Na/K-АТФазы 10

  3. Структура Na/K-АТФазы, сайты связывания ионовиАТФ 12

1.1.5. Регуляция Na/K-АТФазы 16

  1. Ингибиторы Na/K-АТФазы 17

  2. Эндогенные уабаин-подобные соединения (EOLS) и их роль в патогенезе гипертонической болезни , 20

1.2. ЫА/К.-АТФАЗА КАК УНИВЕРСАЛЬНЫ И РЕГУЛЯТОР ТРАНСМЕМБРАННОГО ГРАДИЕНТА НАТРИЯ И КАЛИЯ 21

  1. Генерация мембранного потенциала. 21

  2. Системы транспорта, сопряженные с переносом Na* и К* 22

  3. Регуляция объема клеток 23

1.3. NA/K-АТФАЗА И ВНУТРИКЛЕТОЧНАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ 25

  1. Гены, экспрессия которых регулируется активностью Na/K-АТФазы 25

  2. Сигнальные каскады, запускаемые ингибировштем Na/K-АТФазы 26

1.4. РОЛЬ NA/K-АТФАЗЫ В РАЗВИТИИ КЛЕТОЧНОЙ СМЕРТИ 29

  1. Апоптоз и некроз - два вида клеточной смерти 29

  2. Ингибирование Na/K-АТФазы как фактор защиты клеток от апотоза. 34

  3. Уабаин как инициатор клеточной смерти. 37

1.5. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ СЛЕДУЮЩИЕ ИЗ ОБЗОРА ЛИТЕРАТУРЫ. .42

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46

2.1. Культура клеток .46

  1. Клетки гладких мышц сосудов (VSMC) (vascular smooth muscle cells) 46

  2. Клетки гладких мышц, трансфщированные Е1А аденовирусом (Е1А VSMC) 46

  3. Эпителиальные клетки С7 и CI 1 MDCK 48

  4. Эндотелиальные клетки сосудов (РАЕС) 49

2.2. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК 50

  1. Фазово-контрастная микроскопия , , , 50

  2. Сохранение связи клеток с подложкой 50

  3. Окраска клеток трипановым синим , 51

2.3. БИОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ОЦЕНКИ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТИ КЛЕТОК 51

2.3.1. Деградация МТТ 51

2.4. МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ АПОПТОЗА И НЕКРОЗА 52

  1. Определение клеточного объема... 53

  2. Определение количества фрагментировапиого хроматина 54

  3. Определение содерэ/сания низкомолекулярных фрагментов ДНК, 56

  4. Активность каспазы-3 57

2.5.МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ИОННОГО ГОМЕОСТАЗА КЛЕТОК 58

  1. Определение активности Na*/1С-насоса 58

  2. Определение содержания обмениваемого калия и натрия 55

  3. Определение свободного и обмениваемого внутриклеточного кальция і 59

  4. Измерение внутриклеточногорН. 60

2.6. МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕМЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 61

  1. Определение общей и меченой 3Н-тимидином ДИК 61

  2. Определение экспрессии бечков (Western Blot) 61

  3. Определение экспрессии РНК (Northern Blot) 62

  4. Измерение синтеза РНК и белка 63

2.7. РЕАКТИВЫ 63

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ . 64

3.1. ИНГИБИРОВАНИЕ NA/K-АТФАЗЫ УАБАИНОМ ЗАЩИЩАЕТ КЛЕТКИ ГЛАДКИХ МЫШЦ ОТ АПОПТОЗА,
ВЫЗВАННОГО РАДИОАКТИВНЫМ МЕЧЕНИЕМ ДНК 64

  1. Ингибирование клеточного роста Ґ HJ-тимидином протекает через его включение в ДНК. 64

  2. Сравнительный анализ эффекта [ Щ-тимидина нарост VSMC, эпителиальных и эндотелиальных клеток 66

  3. Влияние [3Щ-тимидина на синтез ДНК 67

  4. Обработка клеток IіНJ-тимидином вызывает их смерть 68

3.1.5. Внедрение [' Щ-тимидина в ДИК клеток вызывает их апоптоз 70

3.2. МЕХАНИЗМ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ РАННЕГО ОТВЕТА В VSMC СОСУДОВ, ВЫЗВАННЫЙ ИНГИБИРОВАНИЕМ
NA/K-АТФАЗЫ 74

  1. Ингибирование Na/K-АТФазы вызывает резкое увеличение экспрессии c-Fos 74

  2. Уабаин вызывает экспрессию c-Fos через увеличение соотношения [Na*]/[iC]i 75

  3. Вызванная уабаином экспрессия c-Fos проходит через увеличение [Na*]i 77

  4. Роль клеточного объема, внутриклеточного рИ и Са2* в инициированной уабаином экспрессии с-Fos 78

3.3. ПОИСКИ НАЧАЛЬНОГО СИПІАЛА, ПРИВОДЯЩЕГО К ГИБЕЛИ КЛЕТОК ЭПИТЕЛИЯ ПОЧЕЧНЫХ КАНАЛЬЦЕВ ПРИ
ДЕЙСТВИИ УАБАИНОМ , 82

  1. Маркеры смерти C7-MDCК клеток при действии уабаина 83

  2. Роль Na/K-АТФазы и внутриклеточных концентраций калия и натрия 89

  3. Роль кальция 94

  4. Роль макромояекулярного синтеза в смерти эпителиальных клеток, инициированной уабаином9 5

4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 97

  1. ИНГИБИРОВАНИЕ УАБАИНОМ NA/K-АТФАЗЫ В VSMC ПОДАВЛЯЕТ АПОПТОЗ, ВЫЗВАННЫЙ РАДИОАКТИВНЫМ МЕЧЕНИЕМ ДНК 91

  2. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ РАННЕГО ОТВЕТА В VSMC СОСУДОВ, ЗАПУСКАЕМАЯ УАЕАИНОМ; ДОКАЗАТЕЛЬСТВА НОВОГО NA+|-OnOCPEflOBAHHOrO СА2+,-НЕЗАВИСИМОГО МЕХАНИЗМА СОПРЯЖЕНИЯ ВОЗБУЖДЕНИЯ И

транскрипции 99

4.3. Некроз в клетках эпителия почечных канальцев, обработанных уабаином, не связан с

ИНГИБИЮВАНИЕМ ИОННЫХ ПОТОКОВ, опосредованных N а/К-АТФазой 103

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 107

выводы, ш

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 115

Введение к работе:

Актуальность проблемы. Na/K-АТФаза - это интегрированный в клеточную мембрану белок, ответственный за транспорт 3Na и 2К ионов против их электрохимических градиентов. Трансмембранные градиенты одновалентных катионов, создаваемые Na/K-АТФазой, необходимы для поддержания мембранного потенциала, клеточного объема и транспорта других ионов и низкомолекулярных органических соединений за счет систем сопряженного транспорта, как то систем NaVH* и Na7Ca2* обмена, Na+,K+,Q -котранспорта, а также котранспорта Na с аминокислотами, глюкозой, фосфатами и нейротрансмиттерами (Blanco and Mercer, 1998; Lang et al., 2000; Mongin, Orlov, 2001). В этой связи неудивительно, что ингибирование этого фермента влияет на целый ряд клеточных параметров. Так, сердечные гликозиды (например, уабаин или дигоксин), природные ингибиторы Na/K-АТФазы, использовались для лечения сердечной недостаточности, некоторьж аритмий и отеков с конца XVIII-ro столетия (Withering 1785; Hoffman, Bigger, 1985). Механизм их действия заключается в том, что, ингибируя Na/K-АТФазу, сердечные гликозиды деполяризуют клеточную мембрану и повышают внутриклеточный уровень Na+. Вследствие этого через Na+/Ca + обменник и погенциал-активируемые Са2+ каналы повышается уровень внутриклеточного Са *, что приводит к увеличению силы сокращений кардиомиоцигов и увеличивает чувствительность клеток гладких мышц к вазоконстрикторам (Blaustein, Lederer, 1999; Glitsch, 2001). При этом, увеличение концентрации кальция внутри клеток ( [Са *]ш ) часто вызывает активацию Са +-зависимьж К^-каналов, которые усиливают отток калия из клетки, вызванный ингибированием Na/K-АТФазы и, таким образом, приводят к ее сжатию, что в клетках ряда тканей может инициировать апоптоз. С другой стороны, увеличение концентрации натрия и отрицательно заряженньж осмолитов может привести к набуханию клетки и к некрозу.

МЙЙ#|Ьо,

В 1999 году было установлено, что обработка клеток гладкой мускулатуры сосудов (ГМК, VSMC) уабаином резко замедляет развитие апоптоза, вызванного устранением факторов роста (Orlov et al., 1999). При исследовании механизма антиапоптотического действия уабаина на ГМК было показано, что этот ингибитор Na/K-АТФазы резко активирует синтез РНК (Orlov et al., 2000b) и что его антиапоптотический эффект устраняется в присутствии ингибиторов синтеза РНК и белка (Orlov et al., 2001). Эти результаты позволили предположить, что защита ГМК от апоптоза в присутствии уабаина осуществляется через экспрессию антиапоптотических генов, которые в свою очередь

контролируются йЙ&иН'йЬЙЙЙАвЫЙгУ (ГРО, early БИБЛИОТЕКА Т

СП 03 К*

response genes - ERG). В отличие от ГМК и клеток ряда других тканей (Falciola et al., 1994; Orlov et al., 1999; Murata et al., 2002), длительная инкубация с уабаином приводит к смерти эпителиальных клеток (MDCK), характеризующейся наличием маркеров некроза (Ledbetter et al., 1986; Bolivar et al., 1987). Механизм двоякого действия ингибиторов Na/K-АТФазы на апоптоз и некроз клеток остается неизвестным. В этой связи целью нашей работы было исследование механизмов вовлечения Na /К -АТФазы в активацию экспрессии генов и развитие клеточной смерти.

Основные задачи исследования

  1. Установить характер влияния Na /К -АТФазы на развитие апоптоза в ГМК, вызванного ионизирующей радиацией.

  2. Установить природу начального сигнала, приводящего к запуску экспрессии генов раннего ответа в ГМК, вызванной ингибированием Na /К -АТФазы уабаином.

  3. Установить природу начального сигнала, приводящего к развитию некроза в клетках эпителия почечных канальцев, обработанных уабаином.

Научная новизна работы. В нашей работе мы впервые показали, что включение в структуру ДНК изотопа (3Н) является достаточным условием для запуска апоптоза в клетках ряда тканей. В этой части работы нами было также установлено, что сигнальный каскад, запускаемый ингибиторами Na/K-АТФазы, воздействует скорее на универсальное звено апоптотического механизма, нежели на процессы, которые связаны с более специфическими начальными сигналами, возникающими при действии индукторов апоптоза различной природы. Мы впервые показали, что ингибирование уабаином Na/K-ЛГФазы вызывает индукцию экспрессии c-Fos через увеличение внутриклеточной концентрации натрия. Этот сигнальный каскад не был опосредован изменением внутриклеточного рН, объема клеток или концентрацией Са * в клетке. Последнее наблюдение является наиболее важным, так как позволяет предложить новый механизм сопряжения возбуждения и транскрипции, который запускается изменениемконцентрации Na+ в клетке и не зависит от Са , вовлеченный в подавление апоптоза. Нами впервые обнаружено, что некроз эпителиальных клеток, развивающийся при действии уабаина, не связан ни с ингибированием ионньж потоков, обеспечиваемых Na/K-АТФазой, ни с резким увеличением соотношения [Na4],,/^*],,,. Это наблюдение позволило нам выдвинуть предположение, что в клетках эпителия почечных канальцев уабаин вызывает изменение конформации а-субъединицы Na/K-АТФазы, что является достаточным условием для ее взаимодействия с

неидентифицированным белком, приводящим к активации сигнального каскада, завершающегося некрозом клеток.

Научно-практическая значимость работы. Данные, полученные нами при исследовании действия ионизирующего излучения на апоптоз, позволяют учитывать этот эффект для предотвращения артефактов, возникающих при использовании 3Н-тимидина для измерения синтеза ДНК и образования фрагментов хроматина. Кроме того, ДНК быстро делящихся опухолевьж клеток накапливает большие количества радиоактивно меченных пуриновьж и пиридиновых оснований и тем самым, должно быть, наиболее подвержены апоптозу. В связи с этим, разработка методов доставки этих соединений к местам скопления опухолевьж клеток, минуя здоровые клетки, может быть полезным приемом в противоопухолевой терапии. Некомпенсированный пролиферацией апоптоз принимает участие в развитии таких заболеваниях, как болезнь Альцгеймера, тератогенез, мышечная дистрофия, измените регуляции иммунной системы. С другой стороны, потеря клетками способности к апоптозу приводит к гиперплазии сердечно-сосудистой системы, отмеченной при гипертонии и атеросклерозе. Мы полагаем, что полученные в нашей работе данные о двояком механизме действия ингибиторов Na/K-АТФазы на апоптоз и некроз будут использованы при разработке новьж фармакологических подходов, которые могут быть применены для лечения болезней, связанньж с нарушением процессов регуляции клеточной смерти.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конгрессе Гипертонического общества Квебека (Монреаль, 2001); четвертом ежегодном конгрессе молодьж ученьж Монреальского университета (Монреаль, 2001); ХГХ-й конференции международного общества гипертонии (Прага, 2002); международном симпозиуме по сердечно-сосудистой фармакотерапии (Монреаль, 2002); четвертом конгрессе по патофизиологии (Будапешт, 2002); конгрессе Канадского сердечно-сосудистого и гипертонического обществ (Эдмонтон, 2002); VI Российской онкологической конференции (Москва, 2002) и XI-м собрании гипертонического общества Квебека (Монреаль, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, полученных результатов, их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из яГ^названий. Работа изложенанаЛЯЗраницах. иллюстрирована_2_таблицами и /^рисунками.

Подобные работы
Матусов Георгий Дмитриевич
Исследование механизма действия простагландинов на протоплазматическую мембрану растительной клетки
Болотина Виктория Марковна
Исследование механизмов блокирования натриевых каналов мембраны нервного волокна биологически активными веществами
Рындина Наталья Ивановна
Исследование механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и разработка способов его предотвращения
Волков Евгений Израилевич
Исследование механизмов генерации ритмов в системах взаимодействующих биологических и физических осцилляторов
Кондратьев Максим Сергеевич
Исследование механизма организации спиральной структуры олигопептидов
Могилевская Екатерина Александровна
Теоретическое исследование механизмов функционирования и регуляции цикла Кребса митохондрии и Escherichia coli
Бершицкий Сергей Юрьевич
Исследование механизма генерации силы в мышце
Искусных Анна Юрьевна
Исследование механизмов окислительно-восстановительного гомеостаза на примере системы "активированные нейтрофилы-пероксидное окисление липидов-антиоксиданты"
Большаков Алексей Петрович
Исследование механизмов митохондриальной деполяризации и кальциевой дизрегуляции, индуцируемой возбуждающим медиатором глутаматом в нейронах мозга
Трапков Владимир Александрович
Исследование биофизических механизмов противоязвенного действия хондроитинсульфата

© Научная электронная библиотека «Веда», 2003-2013.
info@lib.ua-ru.net