Электронная библиотека Веда
Цели библиотеки
Скачать бесплатно
Доставка литературы
Доставка диссертаций
Размещение литературы
Контактные данные
Я ищу:
Библиотечный каталог российских и украинских диссертаций

Вы находитесь:
Диссертационные работы России
Биологические науки
Биофизика

Диссертационная работа:

Двурекова Евгения Александровна. Структурно-функциональное состояние иммуноцитов при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы в условиях УФ-облучения : Дис. ... канд. биол. наук : 03.00.02 : Воронеж, 2005 213 c. РГБ ОД, 61:05-3/498

смотреть содержание
смотреть введение
Содержание к работе:

ВВЕДЕНИЕ 6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 13

ГЛАВА 1. Клетки иммунной системы, их роль в регуляции иммуноло
гических реакций... 13

  1. Функциональные особенности клеток иммунной системы 13

  2. Основные рецепторы на поверхности иммуноцитов 21

  3. Общая характеристика цитокинов. Роль фактора некроза опухоли

в иммунологических реакциях 27

1.4. УФ-индуцированные изменения структурного и функционального

состояния иммуноцитов 33

ГЛАВА 2. Система комплемента: особенности строения, функциони-

^ рования и регуляции активности С4 компонента 38

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 47

ГЛАВА 3. Объекты и методы исследования 47

3.1.Объекты исследования 47

3.2. Методы исследования 47

  1. Выделение лимфоцитов из крови человека 47

  2. Получение Т-лимфоцитов 48

  3. Выделение макрофагов из перитонеальной жидкости мыши 48

  4. Получение супернатанта иммуноцитов 48

  5. Выделение нейтрофилов из крови человека 49

  6. Получение сыворотки крови 50

  7. УФ-облучение исследуемых образцов 50

  8. Инкубация макрофагов с фактором некроза опухоли а 51

  9. Метод иммуноферментного анализа для изучения процессов взаимодействия С4 фактора комплемента с мембранами иммуноцитов 51

3.2.10. Метод иммунофлуоресценции для изучения структурных

.4* свойств мембран иммуноцитов ... 53

3.2.11. Определение функциональной активности С4 фактора системы
комплемента методом гемолитического титрования 54

. 3.2.12. Регистрация и анализ ИК-спектров белка С4 55

* 3.2.13. Регистрация электронных спектров поглощения белка С4 57

3.2.14. Проведение диск-электрофореза в полиакриламидном геле

белка С4 57

3.2.15. Измерение буферной емкости и снятие кривых титрования

белка С4 58

3.2.16. Получение лимфоцитарных и макрофагальных лизатов

для определения концентрации фактора некроза опухоли а и цитоток-
сической активности макрофагов 60

3.2.17. Метод иммуноферментного анализа для определения концен
трации ФНОа в лизатах Т-лимфоцитов 61

3.2.18. Измерение интенсивности люминолзависимой хемилюминес-
ценции иммуноцитов 62

3.2.19. Метод определения ТБК-активных продуктов в суспензии

лимфоцитов 63

  1. Определение пероксидазной активности лимфоцитов 66

  2. Определение супероксиддисмутазной активности лимфоцитов методом люминолзависимой хемилюминесценции 67

  3. Определение цитотоксической активности макрофагов 68

  4. Определение жизнеспособности макрофагов с помощью трипа-нового голубого 69

3.2.24. Статистическая обработка результатов экспериментов 69

* ГЛАВА 4. Влияние УФ-света на процесс взаимодействия С4 фактора

системы комплемента с мембранами иммуноцитов 70

4.1. Взаимодействие С4 фактора системы комплемента с мембранами
лимфоцитов и макрофагов в условиях УФО 70

  1. Влияние УФ-света на функциональное состояние мембраносвя-занногоС4 72

  2. Влияние УФ-света на структурное состояние CR1 -рецепторов с лигандированным С4 на поверхности лимфоцитов и

$ макрофагов .. . 76

4.1.3. Взаимодействие фотомодифицированных иммуноцитов с
сывороточным С4 , 80

4>

4.1.4. Влияние УФ-света на гемолитическую активность белка С4 S7

4Л .5. Влияние УФ-света на сгруктурно-функциональное состояние
сывороточного С4 „ 89

  1. Взаимодействие С4 компонента комплемента с мембранами нейтрофилов крови человека в условиях УФО 99

  2. Определение роли фотомодификаций белка С4 и мембран имму-ноцитов в изменение антителосвязывающей способности изучаемых

систем 105

ГЛАВА 5. Анализ УФ-ішдуцировашшх структурных модификаций

С4 белка системы комплемента 107

  1. Влияние УФ-света на ИК-спектральные характеристики С4 белка системы комплемента 107

  2. Электронные спектры поглощения УФ-облученных растворов С4 109

5.3. Электрофоретические характеристики фотомодифипированного
белка С4 110

5.4. Влияние УФ-света на буферную емкость растворов белка С4 114

ГЛАВА 6. Влияние УФ-света на некоторые функциональные свойства
лимфоцитов крови человека 121

  1. Уровень продукции фактора некроза опухоли а Т-лимфоцитами в условиях УФ-облучения 121

  2. Изучение процессов ПФОЛ, протекающих на мембранах лимфоцитов 124

  1. Влияние УФ-света на хемилюминесцентные свойства лимфоцитов 125

  2. Дозовая зависимость накопления ТБК-активных продуктов

в суспензии лимфоцитов в условиях УФ-облучения 131

6.3. Влияние УФ-света на ферментанивную активность лимфоци
тов 133

6.3Л. Влияние УФ-света на пероксидазную активность лимфоцитов.... 134

4 6.3.2. Влияние УФ-света на супероксиддисмутазную активность лим
фоцитов 140

ГЛАВА 7. Исследование сочетанного действия УФ-света и фактора
некроза опухоли а на функциональную активность макрофагов 143

  1. Изменение цитотоксической активности макрофагов в условиях УФ-облучения 143

  2. Исследование сочетанного действия УФ-света и ФНОа на уровень спонтанной хемилюминесценции макрофагов 147

  1. Исследование уровня жизнеспособности УФ- и цитокинмоди-фицированных макрофагов с помощью красителя трипанового голубого.. 148

  2. Влияние сочетанного действия УФ-света и ФНОа на фагоцитарную активность макрофагов 150

  3. Влияние сочетанного действия УФ-света и фактора некроза опухоли на состояние CR1 -рецепторов с лигандированным С4 на поверхности макрофагов 162

  4. Изучение сочетанного действия УФ-света и ФНОа на супероксид-дисмутазную активность макрофагов 167

  5. О процессах, ответственных за изменение функциональной активности фото- и цитокинмодифицированньгх макрофагов 169

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 172

ВЫВОДЫ 179

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 182

ПРИЛОЖЕНИЕ 208

Введение к работе:

Актуальность проблемы. Функционирование иммунной системы контроли
руется сложной сетью взаимосвязанных информационных сигналов, опосредуе
мых факторами неспецифического гуморального звена иммунитета. Их продукция
и направленное действие на конкретные клетки-мишени определяются сложными
молекулярно-клеточными механизмами. Примеров^ тому может служить система
комплемента, играющая важную роль в нормальной и патологической физиологии
человека. Белки комплемента обеспечивают опсонизацию и лизис чужеродных
і клеток, участвуя таким образом в формировании иммунного ответа. Связывание

активных субфрагментов комплемента со специфическими клеточными рецепто
рами приводит к локальной модуляции физиологических процессов, координации
функциональной активности и кооперации иммуноцитов, что направлено на под-
1 держание местного гомеостаза. В то же время, клеточные рецепторы комплемента,

например CR1-рецептор, являются естественными регуляторами активности самого комплемента.

Помимо системы комплемента в процессах иммунорегуляции задействованы и другие факторы гуморального звена иммунитета, в частности, цитокины, обеспечивающие согласованное функционирование различных типов иммуноком-петентньгх клеток в процессе индукции развития иммунных реакций. Цитокины секретируются многими клетками и представляют собой единую систему регуляции иммунных процессов, процессов воспаления, а также роста, дифференцировки и функциональной активности клеток различной тканевой принадлежности.

Большинство цитокинов обладает плейотропным действием, сопровождающимся модуляцией различных функций, что позволяет рассматривать их как общую систему гомеостатической регуляции клеточной функции, часть сложнейшей цепи взаимосвязанных сигналов, обеспечивающих слаженную работу различных систем в живом организме. Наряду с выполнением специфических функций внутри иммунной системы цитокины формируют сеть коммуникационных сигналов и осуществляют межсистемные связи (А.А. Михайлова, 1992; В Л. Кулинский, Л.С. Колесниченко, 1997). Такой многофакторный контроль функций иммунной системы организма, осуществляемый цитокинами, необходим для повышения надежности и обеспечения вариабельности реакций организма в зависимости от характера агента, вызывающего эти реакции.

В современной медицине для лечения ряда заболеваний используются ре-комбинантяые цитокины, в частности фактор некроза опухоли а (Т.Н. Дранник и др., 1994; А.Е. Chernoffet al., 1995; А.А. Останин и др., 1996; ЕЛ. Варюшина и др., 1998). Его мощное биологическое влияние на иммуногенез, воспалительные процессы и опухолевые клетки позволяет считать фактор некроза опухоли (ФНОа) многообещающим средством иммунотерапии онкологических, воспалительных, инфекционных и аутоиммунных заболеваний, а также при иммунодефицитах, трансплантации органов и тканей (В.П. Шичкин, 1998).

Несмотря на широкие перспективы использования ФНО в клинике, необходимо решить ряд проблем, связанных с подбором терапевтических концентраций, трудностью прогнозирования и контроля реакции организма на цитокиновую терапию.

Нарушения продукции цитокинов продуцирующими клетками, а также процессов взаимодействия гуморальных факторов со специфическими рецепторами

РОС. нлиисздльнАЯ

библиотека

жжСрк

4 иммуноцитов могут лежать в основе формирования патологии на молекулярно-клеточном уровне. В связи с этим изучение межклеточных и клеточно-гуморальных взаимодействий, опосредуемых различными эффекторными молекулами, может внести существенный вклад в понимание патогенеза и привести к поиску новых способов регуляции и повышения эффективности функционирования отдельных звеньев иммунной системы.

Одним из возможных регуляторов процессов взаимодействия между клеточными и гуморальными факторами иммунитета является УФ-свет. Рядом авторов показано, что клеточные и гуморальные компоненты крови, подвергнутые УФ-облучению в физиологических дозах, могут оказывать регулирующее действие на иммунную систему организма в целом. Известно, что УФ-свет индуцирует быстрые структурно-функциональные изменения поверхностных структур имму-нокомпетентных клеток (К.А- Самойлова и др., 1987, 1990, 1991; Е.В. Волгарева и др., 1990; К.А. Samoilova et al., 1996; K.D. Obolenskaya et al., 1998), белков системы комплемента (В.Г. Артюхов и др., 1990, 1993; В.В. Гусинская и др., 1994, 1995а, 19956), уровня цитокинов (Е.Б. Жибурт и др., 1995; D. Kulms et al., 2001).

Несмотря на большое количество экспериментальных данных, молекулярные механизмы регуляторного действия УФ-света на клеточные и гуморальные компоненты иммунной системы раскрыты недостаточно. Практически не учитывается роль конформационных изменений макромолекул в определении степени фотомодификации сывороточных факторов, в частности отдельных белков системы комплемента. Кроме того, в литературе практически отсутствуют работы, посвященные анализу взаимосвязи структурно-функциональных фотомодификаций иммунокомпетентных клеток крови с процессами их взаимодействия с различными факторами гуморального иммунитета, такими как белки системы комплемента и цитокины. Знания об общих закономерностях и механизмах действия УФ-излучения на клеточные и гуморальные звенья иммунной системы позволят разработать научно-обоснованный теоретический фундамент практического использования УФ-света в медицине.

Представляется интересным также изучение возможности регулирования иммунологических процессов сочетанным действием на компоненты иммунной системы естественных модуляторов физической и химической природы (к примеру, УФ-света и фактора некроза опухоли). В частности, используя различные концентрации ФНОа, являющегося медиатором острой фазы воспаления, можно решить ряд проблем, связанных с повышением эффективности применения метода АУФОК при лечении воспалительных процессов различной степени тяжести.

Изучение механизмов, лежащих в основе регуляторного действия УФ-света и ФНОа на иммунокомпетентные клетки, позволит выявить причины возникновения патогенеза и возможность их применения с целью иммунокоррекции и иммунотерапии.

Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы явилось изучение регуляторного действия УФ-света на структурно-функциональное состояние иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) при их взаимодействии с гуморальными факторами иммунной системы.

В связи с этим перед нами стояли следующие задачи:

  1. Изучить влияние УФ-света (240-390 нм, 75,5-2265 Дж/м2) на процесс взаимодействия мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) с С4 фактором системы комплемента;

  2. Исследовать структурно-функциональные фотомодификации С4 компонента комплемента;

  3. Изучить ФНО-продуцирующую способность Т-лимфоцитов и цитотскси-ческую активность макрофагов в условиях УФ-облучения;

4. Оценить вклад процессов пероксидного фотоокисления липидов в изме-
неняе супероксиддисмутазной и пероксидазной активности фотомодифицирован-

ных лимфоцитов;

5. Выявить влияние еочетанного действия УФ-света и фактора некроза опу
холи а на функциональную активность макрофагов.

' Научная новизна. Работа является комплексным исследованием, посвящен-

ным изучению регуляторного действия УФ-света на функциональную активность иммуноцитов по отношению к С4 фактору системы комплемента и ФНОа.

Впервые изучено влияние УФ-света на взаимодействие мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) с С4 фактором системы комплемента и выявлены основные закономерности, обусловливающие данный процесс. Показано, что структурно-функциональные фотомодификации мембран иммуноцитов обусловлены «кэппинг»-эффектом рецепторов с лигандированным С4 фактором комплемента. Разработана схема УФ-индуцированных структурно-функциональных изменений С4 компонента комплемента.

Выявлено иммунокоррегирующие действие УФ-света на уровень продукции фактора некроза опухоли а Т-лимфоцитами, конечный эффект которого определяется исходной концентрацией цитокина и дозой УФ-света. Обнаружена взаимосвязь ФНО-продуцирующей способности лимфоцитов и цитотоксической активности макрофагов с уровнем генерации активных форм кислорода. Исследовано влияние процессов пероксидного фотоокисления липидов на уровень каталитической активности связанной с мембранами лимфоцитов пероксидазы.

Установлено, что УФ-свет и фактор некроза опухоли а оказывают регуля-торное действие на фагоцитарную активность макрофагов. Обсуждается вклад различных процессов (пероксидного фотоокисления липидов, активности НАДФН-оксидазы и супероксиддисмутазы, состояния CR1 клеточного рецептора) в изменение функционального потенциала фото- и ФНО-модифицированных макрофагов.

Практическая значимость. Научные положения диссертационной работы расширяют и углубляют современные представления о молекулярно-клеточном механизме регуляторного действия УФ-света на отдельные звенья иммунной системы.

Фотоиндуцироваяные изменения структурно-функциональных свойств мембран иммуноцитов и отдельных компонентов комплемента необходимо учитывать при обсуждении вопросов, касающихся выяснения механизмов действия УФ-света на молекулярно-клеточном уровне. Полученные экспериментальные данные позволяют выявить общие закономерности регуляторного действия УФ-света на процесс взаимодействия мембран иммуноцитов (лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов) с С4 фактором комплемента.

Эксперименты с использованием фактора некроза опухоли а позволяют разработать новые подходы к иммунокоррекции патологических состояний организма при проведении фармакотерапии и определить возможность применения метода АУФОК на различных стадиях воспалительного процесса с целью повышения эффективности его использования.

Предложенная схема регуляторного действия УФ-света и ФНОа на функциональные свойства макрофагов может быть полезна для понимания молекулярных механизмов иммунокоррегирующего действия метода АУФОК.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге ХХГ века» (СПб., 2000); IV Съезде по проблемам радиационной биологии (Москва, 2001); Ш Съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001); XVITI съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (Казань, 2001); VITI международной конференции по химии и физико-химии олигомеров «Олигомеры-2002» (Черноголовка, 2002); IV международной конференции «Циклы природы и общества» (Ставрополь, 2002); VH Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003); Ш и IV международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002; СПб., 2003); Научной сессии сотрудников Воронежского госуниверситета (Воронеж, 2002; 2003,2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и 8 тезисов, в том числе 3 статьи в реферируемых изданиях.

На защиту выносятся следующие положения:

  1. УФ-свет (240-390 нм) в дозах 75,5-2265 Дж/м2 индуцирует снижение ан-тителосвязывающей способности С4 компонента комплемента в системе из взаимодействующих иммуноцитов и белков системы комплемента, обусловленное как структурно-функциональными фотомодификациями клеточных мембран, так и процессами, протекающими в сыворотке крови.

  2. УФ-индуцированные структурные модификации белка С4 связаны с процессом разворачивания белковой молекулы, сопровождающимся увеличением числа ароматических аминокислот и ионогенных групп на поверхности белковой молекулы.

  3. УФ-излучение в дозах 75,5-2265 Дж/м^ оказывает коррегирующее действие на ФНО-продуцирующую способность Т-лимфоцитов, эффект которого в значительной степени определяется исходной концентрацией цитокина, уровнем генерации активных форм кислорода и дозой УФ-света.

  4. Интенсификация процессов пероксидного окисления липидов на мембранах фотомодифицированных лимфоцитов способствует повышению их суперок-сиддисмутазной и пероксидазной активности, а также снижению каталитической активности связанной с клетками экзогенной пероксидазы.

  5. УФ-излучение в дозах 75,5-2265 Дж/м вызывает разнонаправленные эффекты в отношении цитотоксической и фагоцитарной активности макрофагов. Со-четанное действие УФ-света и фактора некроза опухоли а оказывает модулирующий эффект на функциональное состояние макрофагов.

  6. Схема возможных регуляторных процессов, протекающих при сочетан-ном действии УФ-света и фактора некроза опухоли а на функциональную активность макрофагов.

7 Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает 208 страниц машинописного текста, 24 таблицы, 42 рисунка. Состоит из «Введения», семи глав, «Заключения», «Выводов» и «Приложения». Список литературы содержит 287 работ, из них 139 отечественных и 148 зарубежных.

Подобные работы
Колтаков Игорь Александрович
Исследование структурно-функционального состояния Т-лимфоцитов крови человека при модификации Z-интерфероном и в условиях УФ-облучения
Путинцева Ольга Васильевна
Структурно-функциональные свойства некоторых лигандных форм гемоглобина человека в условиях УФ-облучения и различного микроокружения
Урнышева Валентина Васильевна
Роль параметров системы регуляции перекисного окисления липидов в формировании биологических последствий воздействия неблагоприятных экологических факторов
Шишкина Людмила Николаевна
Особенности функционирования физико-химической системы регуляции перекисного окисления липидов в биологических объектах разной степени сложности в норме и при действии повреждающих факторов
Захарченко Наталия Леруновна
Структура и каталитические свойства системы "трипсин - обращенная мицелла" в условиях изменения температуры
Половинкина Елена Олеговна
Состояние системы перекисного гомеостаза хлоропластов гороха в условиях слабого воздействия физических факторов различной природы
Иванов Юрий Валерьевич
Экспрессия генов ферментов биосинтеза полиаминов у галофитов и гликофитов при засолении и УФоблучении
Зотов Андрей Сергеевич
Особенности взаимодействия сердечно-сосудистой и дыхательной систем настоящих тюленей в динамике функциональных состояний
Белкина Светлана Владимировна
Прогнозирование синергизма мутагенных, канцерогенных и летальных эффектов при взаимодействии различных факторов окружающей среды
Николаева Анна Александровна
Взаимодействие нейромедиаторов, факторов внутреннего подкрепления и регуляторных пептидов. Создание информационной базы

© Научная электронная библиотека «Веда», 2003-2013.
info@lib.ua-ru.net