Электронная библиотека Веда
Цели библиотеки
Скачать бесплатно
Доставка литературы
Доставка диссертаций
Размещение литературы
Контактные данные
Я ищу:
Библиотечный каталог российских и украинских диссертаций

Вы находитесь:
Диссертационные работы России
Биологические науки
Биофизика

Диссертационная работа:

Большаков Алексей Петрович. Исследование механизмов митохондриальной деполяризации и кальциевой дизрегуляции, индуцируемой возбуждающим медиатором глутаматом в нейронах мозга : диссертация... кандидата физико-математических наук : 03.00.02 Долгопрудный, 2007 129 с. РГБ ОД, 61:07-1/1045

смотреть содержание
смотреть введение
Содержание к работе:

Список сокращений 3

Введение 4

Глава 1. Обзор данных литературы 8

Цели и задачи исследования 51

Глава 2. Материалы и методы исследования 52

Глава 3. Результаты исследования 58

Глава 4. Обсуждение результатов 101

Заключение 115

Выводы 116

Благодарности 118

Библиография 119

з Список сокращений

МД, митохондриальная деполяризация

МП, митохондриальная пора

ОКД, отсроченная кальциевая дизрегуляция

Д*РМ, митохондриальный потенциал

NMDA, N-метил-Б-аспартат

[Ca2+]j, внутриклеточная концентрация Са2+

[Sr2*];, внутриклеточная концентрация Sr2*

рН„, рН митохондриального матрикса

рНц, рН цитозоля

Pi, неорганический фосфат (Н2РО4")

2mtRP, рейшио-метрический перикам, селективно экспрессированный в митохондриальном

матриксе

mtYFP, желтый флуоресцентный белок, селективно экспрессированный в митохондриальном

матриксе

cytYFP, желтый флуоресцентный белок, селективно экспрессированный в цитозоле

Введение к работе:

Актуальность проблемы.

Одной из ключевых стадий повреждения нейронов при ряде патологий центральной нервной системы является токсическое действие нейромедиатора глутамата, избыточно выделяющегося и накапливающегося в межклеточном пространстве (Duchen, 2004;Nicholls, 2004). Исследования причин глутаматной нейротоксичности показали, что вход Са через NMDA подтип глутаматных каналов и последующее накопление Са2+ в митохондриях являются основными факторами, приводящими к клеточной гибели (обзоры (Khodorov, 2004;Nicholls and Budd, 2000)).

В исследованиях, проведенных на первичных культурах нейронов, было обнаружено, что гибель нейронов после глутаматного шока тесно связана с развитием вторичного подъема внутриклеточной концентрации Са ([Са ];). Это вторичное увеличение [Са \{ получило название отсроченной кальциевой дизрегуляции (ОКД) (Tymianski et al., 1993). В последующих исследованиях было продемонстрировано, что ОКД сопровождается синхронной митохондриальной деполяризацией (МД) (Vergun et al., 1999). Было также показано, что МД играет решающую роль в механизме глутамат-индуцированного нарушения Са2+ гомеостаза (Khodorov et al., 1996;Ходоров и др., 2001) и что циклоспорин А (ЦсА) и некоторые его производные замедляют или предотвращают развитие сильной МД и вторичного повышения [Са ]; в культивируемых нейронах центральной нервной системы (Vergun et al., 1999;Alano et al., 2002). Принимая во внимание способность этих веществ противодействовать формированию митохондриальной поры (МП) в изолированных митохондриях, было сделано заключение о том, что открывание МП приводит к коллапсу митохондриального потенциала (Д*РМ) во время глутаматного воздействия. Однако этот вывод в настоящее время поставлен под сомнение рядом других исследований, в которых не удалось воспроизвести защитный эффект ЦсА (Isaev et al., 1996;Castilho et al., 1998;Chinopoulos et al., 2004;Pivovarova et al., 2004). Эти противоречия и некоторые

5 ограничения, связанные с применением ЦсА даже на изолированных митохондриях

(Brustovetsky and Dubinsky, 2000) побудили нас использовать для изучения этой проблемы

новый экспериментальный подход, основанный на сравнительном анализе изменений

митохондриального и цитозольного рН (рНм и рНц, соответственно). Хорошо известно, что

глутамат вызывает закисление цитозоля (Пинелис и др., 1992; Hartley and Dubinsky, 1993).

Однако влияние глутаматного воздействия на динамику нейронального рНм in situ до сих пор

не изучалось. Между тем, заманчиво было предположить, что открывание

митохондриальной поры вызовет снижение рНм (поскольку рНц меньше рНм), в то время как

блокада открывания МП предотвратит развитие этого митохондриального подкисления.

Чтобы проверить это предположение мы исследовали изменения рНц и рНм во время

длительного глутаматного воздействия, используя рН-чувствительные флуоресцентные

белки, селективно экспрессированные в цитозоле и митохондриях (cytYFP, mtYFP, и

экспрессируемый в митохондриях перикам 2mtRP (Porcelli et al., 2005;Nagai et al., 2001). Эти

измерения мы проводили в сочетании с одновременным мониторингом изменений [Ca2+]j. В

параллельных экспериментах мы регистрировали изменения [Ca2+]j и AW». Измерения

проводились как в контрольных условиях, так и после воздействий, которые препятствуют

открыванию МП в изолированных митохондриях. К числу таких воздействий, как известно,

относятся замена внеклеточного Са2+ на Sr24 замена или применение ЦсА (Bernardi et al.,

1992).

В результате всех проведенных исследований мы пришли к заключению о существовании двух альтернативных механизмов глутамат-индуцированной отсроченной МД: открывание поры и беспоровый механизм, при котором происходит подщелачивание митохондриального матрикса.

Научная новизна

В нашей работе впервые использован новый прием для изучения роли митохондриальной поры в механизмах дестабилизации кальциевого гомеостаза нейронов

при длительном действии глутамата - измерения рН митохондриального матрикса (рНм). Измерения рН„ in situ в сочетании с другими подходами были использованы для демонстрации роли митохондриальной поры в развитии МД.

Нами впервые проведено сопоставление динамики [Са ]j и рН в цитозоле (рНц) и митохондриях при длительном глутаматном воздействии. Впервые показано, что снижение рН„ во время глутаматного воздействия имеет двухфазный характер, причем вторая фаза падения рНм возникает с некоторой задержкой после начала ОКД. Мы также впервые обнаружили, что антагонисты митохондриальной поры (циклоспорин А и ионы Sr2"*") не предотвращают развитие ОКД и сильной МД, но существенно изменяют динамику рНм во время развития ОКД. Результаты этих экспериментов свидетельствуют в пользу того, что митохондриальная пора участвует в развитии ОКД и МД при глутаматном воздействии.

Впервые проведено сопоставление изменений морфологии митохондрий и динамики [Са ]і и рНм во время глутаматного воздействия. Мы показали, что начало вторичного митохондриального подкисления сопровождается изменениями митохондриальной формы, которые, согласно имеющейся литературе, можно рассматривать как митохондриальное набухание. Впервые показано, что в Si* -содержащей среде глутаматное воздействие не вызывает никаких изменений митохондриальной морфологии. На основании того, что митохондриальное набухание является характерной чертой формирования митохондриальной поры и того, что во время глутаматного воздействия оно возникает лишь в Са -содержащей среде было сделано заключение о том, что вторичное митохондриальное подкисление и сопровождающее его митохондриальное набухание являются следствием открывания митохондриальной поры.

Впервые показано, что сильная МД, развивающаяся во время глутаматного воздействия в присутствии цианида, обусловлена снижением активности митохондриальной АТФ-синтазы вследствие глутамат-индуцированного уменьшения внутриклеточного уровня АТФ.

7 Положения, выносимые на защиту

  1. Вторичное митохондриальное подкисление, сопровождающее отсроченную кальциевую дизрегуляцию (ОКД) во время глутаматного воздействия, является следствием открывания митохондриальной поры.

  2. В присутствии ингибиторов классической митохондриальной поры (ионов Sr2* или циклоспорина А) развитие сильной митохондриальной деполяризации (МД), сопровождающей ОКД, происходит по «беспоровому» механизму.

  3. Существует два альтернативных механизма МД, сопровождающей ОКД: (1) открывание митохондриальной поры, ведущее к коллапсу митохондриального потенциала и закисленню матрикса, и (2) беспоровая МД, сочетающаяся с митохондриальным защелачиванием. В отсутствии блокаторов митохондриальной поры глутамат-индуцированная МД в большинстве нейронов возникает только при активации митохондриальной поры.

  4. В основе развития сильной МД, наблюдающейся во время глутаматного воздействия в присутствии цианидов, лежит быстрое истощение АТФ, необходимого для поддержания митохондриального потенциала в условиях, когда этот потенциал генерируется реверсированной митохондриальной АТФ-синтазой.

Подобные работы
Матусов Георгий Дмитриевич
Исследование механизма действия простагландинов на протоплазматическую мембрану растительной клетки
Болотина Виктория Марковна
Исследование механизмов блокирования натриевых каналов мембраны нервного волокна биологически активными веществами
Рындина Наталья Ивановна
Исследование механизма инициации кальциноза трансплантатов клапанов сердца и разработка способов его предотвращения
Волков Евгений Израилевич
Исследование механизмов генерации ритмов в системах взаимодействующих биологических и физических осцилляторов
Кондратьев Максим Сергеевич
Исследование механизма организации спиральной структуры олигопептидов
Пшежецкий Дмитрий Валерьевич
Исследование механизмов влияния Na/K-АТФазы на регуляцию экспрессии генов и развитие клеточной смерти
Бершицкий Сергей Юрьевич
Исследование механизма генерации силы в мышце
Искусных Анна Юрьевна
Исследование механизмов окислительно-восстановительного гомеостаза на примере системы "активированные нейтрофилы-пероксидное окисление липидов-антиоксиданты"
Могилевская Екатерина Александровна
Теоретическое исследование механизмов функционирования и регуляции цикла Кребса митохондрии и Escherichia coli
Трапков Владимир Александрович
Исследование биофизических механизмов противоязвенного действия хондроитинсульфата

© Научная электронная библиотека «Веда», 2003-2013.
info@lib.ua-ru.net